- 实验背景
胰腺起源于肠管内胚层( gut endoderm) ，它是脊椎动物原肠胚形成后三个胚层之一，经过一系列的信号调节和逐级转录因子调节最终发育为成熟的器官。已有的体内外研究显示, 在胰岛的发育和再生过程中, 转录因子Mnx1、Pdx1、Ngn3、Grg3、Nkx2.2、Nkx6.1、MafA等影响胰腺内分泌细胞的增殖和分化。
本实验中主要涉及Sox17,Pdx1,Ngn3,MafA四种转录因子。其中，Sox17(SRY-related HMG-box gene )属于Sox家族中的F族在胚胎发育中的原始及终末内内胚层分化阶段发挥激活作用。研究表明，Sox17对内胚层的发生发展有至关重要的作用。Pdx1(pancreatic and duodenal homeobox 1)、 在胚胎发育过程中促进胰腺的早期发育和晚期beta; 细胞分化，在成熟beta; 细胞中，Pdx1 具有维持beta; 细胞的形态和正常功能，尤其是维持胰岛素分泌基因的正常运行。Ngn3 ( neurogen in 3) 是NOTCH 信号通路下游的一种BHLH 转录因子，在CNS 和胰腺中都有表达，Ngn3 是胰腺内分泌细胞分化的重要调控因子，研究证实胰腺所有内分泌细胞的发育均需要Ngn3 的调控。MafA(v-maf musculoaponeurotic fi brosarcoma oncogene homolog A) 是v-maf 原癌基因家族的成员，是唯一特异存在于胰岛beta; 细胞的转录因子。在胚胎形成时期，MafA 与MafB 共同表达于胰岛素阳性的beta; 细胞，而在成人胰腺中，仅MafA 表达于beta; 细胞，参与调节胰岛素合成、分泌和糖代谢等相关基因的表达。转录因子在胰岛发育起到了极其重要的作用，转录因子的异常亦与糖尿病的发生有着非常密切的关系。
慢病毒是在人类免疫缺陷Ｉ型病毒（ＨＩＶ－１）基础上发展起来的基因治疗载体，具有携带基因片段容量大、转染效率高、宿主范围广、长期稳定表达等优点，现已经成为转移目的基因的理想载体并用于临床治疗。经研究实验发现，慢病毒载体作为一种高效转基因载体，可以感染干细胞、神经细胞等多种细胞类型，已成功应用于小鼠、牛、猪等动物研究中。慢病毒载体尤其适用于干细胞，用携带绿色荧光蛋白ZsGreen1的慢病毒载体来转染一个良好的细胞克隆，收集细胞上清液感染新鲜的293T细胞，在荧光显微镜下检测到了绿色荧光蛋白的表达，说明有慢病毒产生。因此，我们选择慢病毒包装的方法来将与胰岛发育相关的基因转染到小鼠脂肪间充质干细胞中，检测目的基因在小鼠脂肪间充质干细胞中的表达，观察其有无促进间充质干细胞向胰岛beta;细胞诱导分化的能力。
间充质干细胞是来源于中胚层的成体干细胞，是一种具有自我更新和多向分化潜能的多能细胞。在20 世纪70 年代Friedenstein等首先从骨髓中成功分离出间充质干细胞。是造血微环境中的一种重要细胞成分，可以向多种组织如骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪及基质细胞增殖分化，而且免疫原性弱，是组织工程理想的种子细胞来源。此外，间充质干细胞易于外源基因的转染和表达，在细胞治疗和基因治疗中也有着广泛的应用。目前临床实验证实间充质干细胞移植可用于组织的修复及治疗间充质组织遗传缺陷性疾病，具有广阔的临床应用前景。
间充质干细胞通过小分子化合物和生物大分子诱导生成胰岛素分泌细胞已被广泛研究，说明间充质干细胞具有转分化为胰岛素分泌细胞的潜能。谱系重编程是另一种诱导某种细胞转分化为目的细胞的方法，其要点是通过过表达外源基因（主要是发育学中关键的转录因子），迫使细胞命运发生直接转变。谱系重编程的方法已在诱导iPS细胞中得到普遍使用，此外，重编程法诱导生成各种体细胞如肝细胞、心肌细胞的方法也相对成熟。然而，通过谱系重编程的方法诱导间充质干细胞生成胰岛素分泌细胞的研究尚不深入。本课题拟使用慢病毒作为载体，将构建为多顺反子的胰岛beta;细胞发育相关转录因子转入脂肪间充质干细胞中，以期其向胰岛素分泌细胞转化。
- 实验目的和意义
利用慢病毒载体将含胰岛发育相关基因的目的质粒转染至脂肪间充质干细胞，从而促使脂肪间充质干细胞向胰岛beta;细胞重编程。
- 实验内容
- 将目的质粒利用慢病毒载体转染至293T细胞中。
- 慢病毒滴度，MOI检测。
- 检测293T细胞的转染效率。
- 将目的基因利用慢病毒载体转染至小鼠脂肪间充质干细胞中。
- 检测目的基因在小鼠脂肪间充质干细胞中的表达。
- 通过QPCR、ELISA、免疫荧光，观察其有无促进间充质干细胞向胰岛beta;细胞诱导分化的能力。
- 预期结果
- 成功将含胰岛发育相关基因的目的质粒转移到小鼠脂肪间充质干细胞中。
- 检测到目的基因在小鼠脂肪间充质干细胞中成功表达。
- 检测到胰岛beta;细胞相关基因在重编程后的细胞中表达。
- 可行性分析
1. 在实验前已成功构建出了含Sox17,Pdx1,Ngn3,MafA四种转录因子串联的多顺反子目的质粒。
2. 在实验前期已大量培养了后期需要用到的小鼠脂肪间充质干细胞并鉴定。
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