1. 课题研究背景
肺癌是全世界发病率最高的恶性肿瘤，每年约有138万患者死于肺癌，其中非小细胞肺癌（NSCLC）发病率最高。传统的化疗和放疗由于缺乏特异性，取得疗效的同时也往往给患者带来较大的副作用[7]。因此，选择肺癌细胞特异的分子靶点，应用针对该靶点的药物进行治疗，在取得明显疗效的同时又避免对正常细胞的伤害的治疗模式，越来越被认同。肺癌分子靶向治疗常用的治疗靶点有：细胞受体、信号传导和抗血管生成等，其中表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）是目前最为主要的靶点[4]。
表皮生长因子受体在细胞信号传导通路中起重要作用，一旦被激活，可导致肿瘤细胞内酪氨酸蛋白激酶活化和受体自身磷酸化，从而促使细胞增生、分化、转移、血管生成及凋亡抑制。EGFR受体抑制剂包括小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor, TKI）和单克隆抗体。EGFR-TKI通过阻断细胞受体的三磷酸腺苷结合位点，阻止下游信号传递而产生抑制肿瘤作用。但是，大规模的临床实验中发现，在不同的病人中EGFR-TKI的疗效差异很大。对未经选择的病人，使用EGFR-TKI的总有效率为8%-12%；而在非吸烟、女性和亚洲人中，有效率高于20%[11]。2004年，Lynch和Paez等首次提出，EGFR-TKI对不同NSCLC的治疗效果的差异是由于EGFR外显子的突变状态不同。有研究证实了携带EGFR活性突变患者接受EGFR-TKIs治疗的PFS比起接受传统治疗的患者显著延长，而携带野生型EGFR基因的患者使用传统治疗的PFS较长[7]。这个构象的改变说明与野生型相比，EGFR突变基因的酪氨酸激酶使EGFR-TKIs与ATP结合的能力增强，从而使EGFR-TKIs更有效地阻断癌症细胞增殖和生存的区域和信号通路[4]。
然而，在临床实践中，大多数患者在接受EGFR-TKI治疗6-12个月后，都不可避免地发生TKI耐药，随后肿瘤进一步恶化。耐药的产生可能存在多种机制，包括T790M 突变、K-ras基因突变、C-Met基因扩增、BRAF基因突变、BIM多态性缺失、EMIA-ALK融合基因突变及上皮间充质转化等[2]，其中最常见的是T790M基因突变。目前研究表明，T790M 基因还具有一定预测疗效和导致较差的预后作用[1][5]。基于这些数据，准确鉴定患者的EGFR突变类型对决定晚期NSCLC患者的治疗方案至关重要[3]。
2. 目前常用的EGFR突变检测技术
EGFR的主要突变位点包括EGFR-TK区域的18-21外显子。其中19外显子在746-750氨基酸处的缺失突变和21外显子突变（L858R）占所有突变的90%。 其他活性突变有18外显子（719密码子）突变和20外显子缺失突变（T790M突变）等。
检测EGFR突变的方法主要被分为两个大类：筛选方法检测18-21外显子的所有突变包括异常变异；靶向方法测定特定已知的突变[7]。最为经典的是直接测序法，然而直接测序法的灵敏度较低（突变DNA需足够多）且耗时久，近年来已发展了许多灵敏度更高、周转时间更短的检测突变的其他方法。常用方法有焦磷酸测序法、dHPLC、HRMA、TaqMan PCR、ddPCR、突变体富集PCR、ARMS、PCR-RFLP、IHC、PNA-clamp SmartAmp2等[6][9][10]。其中直接测序法、HRMA、突变体富集PCR等多种方法既可以作为筛选性方法也能作用靶向性方法[7]。
3. 研究目标
（1）建立核酸侵入实时定量PCR的反应方法，实现实时荧光定量PCR的高灵敏、实时监测和核酸侵入反应的高特异性、高通用性和不易引起交叉污染的完美结合。
（2）建立核酸侵入实时定量PCR，用于检测肺癌患者的EGFR基因的突变以指导NSCLC患者的个体化用药。
