1.研究背景
许多恶性传染性疾病的病原体能够通过血液传播，如乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV）、丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus，HCV）、人类免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirus，HIV）和梅毒螺旋体（Treponemiapallidum，TP）等。因此，血液安全性筛查是采血以及临床输血前的必要检查项目[1]。世卫组织建议，输血所用的所有捐献血液至少应进行HBV、HCV及HIV病毒筛查。
2.现有的病毒检测技术
2.1免疫学方法
免疫学方法在病原体检测的灵敏度、耗时、成本等方面有了长足的进步，但需要制备高质量的抗原、抗血清。这一过程对专业知识要求高，耗时长，存在较大的风险性，成本高昂。免疫法以病原体抗原为检测对象，不同种属间或遗传物质突变导致的病原性质差异有时不能反映在待检抗原上，因此该方法经常遇到难以对某些病原种属亚类进行准确区分的难题。在对人、动物病毒的检测方面，以抗原抗体为基础的检测方法还存在窗口期问题，可能导致漏检率增加，继而引发血液安全问题、加速疫情蔓延、耽误疾病治疗等[2]。
2.2病毒核酸检测
相比免疫学方法，以病原体核酸为检测对象的筛查方法的检测目标更直接，通用性和灵活性更好，成本相对低廉且分析通量高。这类方法中PCR技术的应用最为广泛[3]。PCR方法可分为终点检测和实时检测两大类。以凝胶电泳为基础的传统PCR方法因灵敏度较低且容易造成扩增子污染，较少在检测实验室使用。实时PCR技术无需对产物进行开盖检测，即可实现对靶标分子的定量。这些以PCR技术为基础的病原体检测方法需要精确的温度控制或实时荧光检测设备甚至流式细胞仪、芯片点样扫描仪等昂贵的仪器，检测时间相对较长，因而难以在资源有限的实验室、野外或者现场推广应用。
近年来，研究人员开发了多种恒温核酸扩增技术[4]，这些技术不仅降低了对仪器设备的温控要求，还显著缩短了反应时间，因此更加适合应用于野外和现场检测。恒温核酸扩增技术依靠非温度循环的方法产生单链引物结合位点，然后在靶特异引物的引发下以DNA或RNA为模板进行聚合反应。模拟天然生物合成是实现等温扩增的重要策略。例如解旋酶依赖的放大（Helicase-DependentAmplification，HDA）、重组酶放大法（RecombinasePolymeraseAmplification，RPA）、滚环扩增（RollingCircleAmplification，RCA）、链置换扩增技术（StrandDisplacementAmplification，SDA）、核酸序列为基础的扩增（NucleicAcidSequenceBasedAmplification，NASBA）和嵌合引物起始的核酸放大（Chimericprimer-initiatedamplificationofnucleicacids，ICAN）等。这些方法各有优势，但存在需额外高温变性（如HDA）、人工处理（如RPA）、反应时间较长（如HDA、NASBA、ICAN需大于1h）或方法设计复杂（如RPA、RCA）等缺点，而且多数方法涉及多种酶的共同作用，因此方法建立和优化较为困难。
另一种等温扩增设计以单酶扩增为主要特点，通过特殊的引物设计使扩增产物中不断产生可供引物结合的单链区域。该策略的代表方法为环介导等温扩增技术（Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）。LAMP首先由日本学者Notomi等人于2000年创立[5]，后经反应原理、产物检测、应用平台等方面不断研究改进，得到成熟和完善。LAMP反应通常在60-65C下进行，通过三种引物和链置换活性DNA聚合酶的协同作用首先形成含单链区域的哑铃状结构中间体，进而引发高效的链置换合成反应。LAMP反应中引物数多，因此具有很高的特异性。该法无需预变性且扩增速度很快，反应时间一般在1h以内，甚至可在15min内完成。LAMP法的灵敏度和实时PCR方法接相近，且通常比传统PCR法高1-2个数量级[6]。
具体原理为：LAMP引物由覆盖4-6条引物组成，其核心引物为外引物（F3/B3）和内引物（FIP/BIP），环状引物位于F2和F1或B2和B1之间，可起到加速反应进行的作用[7]。FIP（BIP）由F1c（B1c）和F2（B2）两部分，它将序列的互补性引入扩增产物中，使其能自发形成供引物退火的单链环状结构，促使聚合反应与恒温条件下持续进行。内引物通过双链模板的呼吸作用与靶序列结合，并在链置换活性DNA聚合酶的作用下起始延伸反应。此后外引物可在内引物的外侧引发新的延伸反应，并将内引物的延伸产物置换出来。而另一方向的内引物和外引物的外侧可进行相似的反应，最终产生哑铃状结构的中间体。此时大量的内引物和环状引物可分别以F2到F1（B2到B1）和F1到F2（B1到B2）的方向和单链环形区域结合，继续引发延伸反应。故环状引物通过增加引发位点而显著加快了反应速度。在链置换合成中，哑铃状中间体以及带单链环形区域并逐渐延长的双链产物将不断形成，使得反应可在恒温条件下持续、快速地进行。最终的LAMP产物为长度不等、反向串联重复的靶序列混合物。
