一、课题解决的问题利用原核系统表达糖基转移酶候选基因,通过生化方法鉴定了一个新的糖基转移酶基因。
将候选酶基因转到pET-28a的原核表达载体上,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。
二、研究方法1.糖基转移酶基因克隆1.1 重测序后找到目的基因,设计特异性引物1.2 PCR扩增目的基因1.3 目的DNA的1%琼脂糖凝胶电泳(跑胶并切胶回收目的基因)1.4目的基因和质粒双酶切并纯化1.5 T4连接反应(过夜连接)1.6 CaCl2法制备大肠杆菌DH5alpha;感受态细胞1.7 重组质粒热激法导入大肠杆菌DH5alpha;感受态细胞1.8涂抗性平板过夜培养后挑单克隆进行PCR检测1.9阳性克隆于LB培养基摇培,提取重组质粒1.10热激法将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞1.11涂抗性平板过夜培养后挑单克隆进行PCR检测,阳性克隆保存。
2.糖基转移酶活性验证三、文献综述枯草芽孢杆菌中糖基转移酶的研究进展1.枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis) 是一类广泛分布的革兰氏阳性杆状好养型细菌,在土壤、植物根际体表等外界环境中广泛存在,并且具有无致病性,环境兼容性好、不易产生抗药性等优点。
枯草芽孢杆菌可利用的营养物质种类十分丰富, 这决定了其自身含有丰富的产酶系统, 可以分泌多种酶和抗生素,具备生产多种酶的应用潜力,而且还具有良好的发酵基础,用途十分广泛,国内外有众多研究单位和学者对此菌性能有过深入系统研究,也积累了丰富的研究资料,应用也涉及发酵、病虫害防治、养殖业、环境修复等各个领域。
综上所述,枯草芽孢杆菌作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已广泛应用于工业、农业、医药卫生、食品、畜牧业、水产及科研诸领域。
2.糖基转移酶糖基转移酶(glycosyltransferase)是专门负责催化分子的糖基化修饰反应的酶类,它将活性糖基从供体(通常是尿嘧啶核苷二磷酸-葡萄糖 UDP-glucose)转移到激素、次级代谢产物、病原菌侵染物以及植物内外源性毒性物质等一系列植物小分子化合物受体上。
糖基转移酶可以改变化合物的水溶性,从而改变生物利用度和生物活性。
糖基转移酶组成了一超家族,可以合成生物分子的碳水部分,包括蛋白、脂类、甾体类和其他小分子,可以根据各自不同的糖基供体和受体可以分成98个家族(CAZy database, March 2016)。
在98家族中,家族1糖基转移酶包含来自植物、动物、真菌、细菌的UDP-糖基转移酶。
