开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、课题的研究背景、意义和目的
手足口病（Hand, foot and mouth disease，HFMD）主要是由肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）和柯萨奇病毒A16型（Coxsackievirus A16，CoxA16）等肠道病毒引起的急性传染病，多发于5岁以下的儿童。典型症状为手掌、足掌、足趾及口腔内出现斑丘疹、疱疹，疱疹周围可有炎性红晕，并伴有口痛、厌食、低热等症状。多数轻症患儿病程约一周，可自愈，少数重症患儿病程快且致死率高。目前尚无有效的药物能够用于治疗重症HFMD，重症HFMD的治疗主要依赖于早期发现和对症治疗。热毒宁注射液属于中成药，具有清热解毒的功效，可用于治疗手足口病。本课题通过对比HFMD患儿使用热毒宁前后的Th1/Th2细胞亚群变化情况来研究热毒宁对手足口病的治疗机理。
二、实验内容
1、样本收集及预处理
本实验以患者外周血为样本。患者临床血样1400 r/min常温离心后，利用经典的Ficoll密度梯度离心法分离得到外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。Ficoll密度梯度离心后，离心管中液体应分为四层，最下层主要为红细胞和粒细胞沉淀，中间层为淋巴细胞分离液，最上层为血浆，在中间层和最上层液面交界处有一层明显的乳白色云雾状狭带，此带富含单核细胞和淋巴细胞（PBMCs）。
2、免疫磁珠分选CD4 T细胞
24孔板中加入anti-CD3孵育进行anti-CD3预包被。PBMC去除贴壁细胞后细胞计数，调整细胞浓度，按照每10^7个细胞加入20 mu;l人CD4磁珠和80 mu;l MACS buffer的比例将三者轻轻混匀，4℃避光处孵育后，向细胞沉淀中加入适量的MACS buffer制成标本液。标本液过LS磁柱固定后，加入MACS buffer洗脱,得CD4 T细胞。
3、热毒宁和naiuml;ve CD4 T细胞体外共孵育
将naiuml;ve CD4 T细胞浓度调整为3times;10^5个/mL，与热毒宁按一定比例加入24孔板中，其终体系为1 mL，并加入终浓度为2 mu;g/mL human anti-CD28使T细胞活化，放置于37℃，5% CO2培养箱中共孵育。
