研究目的和意义
科学家对陆栖放线菌的研究已经取得了重大进展, 到目前为止, 人类所用的抗生素基本上来自于陆栖放线菌。但从陆栖放线菌中发现新的抗生素的几率正缓缓下降, 研究前景不容乐观。[1]随着细菌耐药现象的增多，临床上迫切需要新的抗生素避免无药可治的窘境。近年来，海洋极地放线菌的次生代谢产物是产生新抗生素的重要来源，而作为极端微生物代表之一的极地海洋放线菌的逐渐成为关注热点。[2]但是大多数研究及局限于抗肿瘤活性筛选，忽略放线菌能够产生抗生素是最本质的特征，不仅导致先导化合物发现效率不高，而对于宝贵的菌种资源也是极大的浪费，对海洋放线菌的研究表明，海洋放线菌产生的抗生素, 不仅结构新颖而且活性代谢产物也是最多的，基于此，实验室在前期海洋放线菌的研究基础上，发现了一株北极海洋放线菌，其次级代谢产物具有抗临床耐药菌的活性。[3]为此,本课题拟进行海洋极地放线菌活性代谢产物的分离纯化，以期为抗耐药菌新药的研发提供先导化合物。
可行性与创新性
海洋微生物处于低温、高压、寡营养的特殊环境, 生物多样性远远超过陆地生物, 其许多重要次级代谢产物是陆地生物所没有的,因此, 是寻找和发现新药活性先导化合物的重要资源。海洋微生物中放线菌具有很强的再生、防御和识别能力, 海洋环境下的进化过程造就了其独特的代谢方式, 从而产生大量结构新颖的代谢产物, 以适应周围极端的生存环境。据不完全统计, 近年来50% 以上新发现的海洋微生物活性物质是由海洋放线菌这个庞大的分类群产生的, 所以海洋放线菌具有开发应用的巨大潜力。[4][5]
初步筛选结果表明，北极海洋放线菌N-2的次生代谢产物具有对临床多重耐药菌抑制作用效果。这些结果初步显示了极地海洋放线菌次生代谢产物在抗多重耐药菌活性方面有着进一步挖掘的潜力。[6]本课题主要采用大孔树脂对发酵液的生物活性成分进行富集，通过柱色谱、高效液相色谱和薄层色谱等分离纯化技术对富集成分进行分离纯化。为实验室对化合物的进一步研究打好基础研究。
研究内容与手段
经过对N-2的发酵产物的早期理化性质的研究，结合生物活性的跟踪测试，通过有机溶剂萃取的代谢产物，硅胶柱层析、薄层层析的活性组分的分离，高效液相色谱制备等方法对极地海洋放线菌进行分离纯化。[7]
- 仪器与药品
葡萄糖,可溶性淀粉,硝酸钾,蛋白胨,牛肉浸膏,酵母提取物,琼脂粉,氯化钠,三氯甲烷, 二氯甲烷,乙腈,甲醇,乙醇,大孔树脂D101,柱层层析硅胶（试剂级）,薄层层析硅胶(试剂级),ODS-C18,Sephadex LH-20,替加环素，恒温摇床,恒温水浴锅,HH-2数显恒温水浴锅,恒温培养箱灭菌器,超净工作台,离心机（Anke TGL-16B）,离心机（Anke LXJ-ⅡB）,电子称（ACCULAB）,Delta 320-S PH计,101-1型烘箱等。
- 研究方法
⑴发酵液过大孔树脂，依次用20%乙醇-水、40%乙醇-水、60%乙醇-水、80%乙醇-水、95%乙醇-水进行洗脱至颜色很淡。各组分经减压浓缩蒸干，再用甲醇溶解经抑菌活性检测，确定活性组分。
⑵活性组分进行反相硅胶层析柱，依次用5%甲醇-水、20%甲醇-水、40%甲醇-水、60%甲醇-水、80%甲醇-水、100%甲醇洗脱至洗脱液颜色很淡，减压浓缩蒸干后用甲醇溶解检测抑菌活性。活性部位再次经反相硅胶柱层析，依次用水、3%乙腈-水、6%乙腈-水、10%乙腈-水、15%乙腈-水、20%乙腈-水、40%甲醇-水、100%甲醇洗脱至洗脱液颜色很淡为止，减压浓缩蒸干后用甲醇溶解检测抑菌活性。
