一、选题意义
硝化应激（nitrosative stress）指机体对活性氮族（reactive nitrogen species，RNS）的高应激性，主要表现为病理过程中过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite，ONOO-）过量生成，从而诱发细胞内蛋白质酪氨酸硝基化等分子事件，并最终导致细胞损伤或凋亡级联反应。缺血性脑损伤病理过程中，硝化应激稳态失衡与血脑屏障及神经血管单元破坏密切关联，近年来以抗硝化应激来进行神经血管保护的药物研究受到关注。通过减少ONOO-生成和清除过多的ONOO- 来对抗硝化应激损伤将有可能成为防治缺血性脑血管病的策略之一。硝化应激参与介导了缺血性脑损伤、炎症、心血管疾病和神经退行性紊乱等多种疾病的病理损伤过程。除了可使含硫基团氧化、羟基化之外，硝化应激亦可经由蛋白质过度硝基化导致脂质过氧化、细胞膜损伤、功能酶灭活及细胞凋亡级联反应等，在多种疾病发生发展中有重要作用.。ONOO- 是一个强硝化剂和氧化剂，在生理pH 条件下显示最强的硝化能力。体内ONOO- 与其共轭酸过氧亚硝（HOONO）都可直接氧化过渡金属中心或巯基，生成·NO2 或NO2-，过渡金属中心则形成氧合金属配合物。ONOO-还能裂解产生多种毒性代谢产物，引起膜脂质、结构蛋白和DNA 损伤在生理条件下，蛋白质硝基化水平非常低，在没有靶分子存在时，细胞内ONOO- 大部分会转化为NO3-。但在缺血、炎症等病理状况下，ONOO- 及其衍生物的积聚可加剧病理损伤。细胞内众多蛋白质都可能成为ONOO- 的作用靶点，由于蛋白质结构、定位、细胞内浓度及与其他蛋白质相互作用的差异决定了硝化应激是一个选择性修饰特定酪氨酸残基的过程。以硝化应激及其相关信号通路为靶标的治疗策略，同时兼顾新药研发，也让我们有理由期待从实验室向临床治疗转化的长足进步。
泛素化是体内蛋白质翻译后重要修饰之一,是蛋白质降解的信号.泛素连接酶E3是泛素化过程中的关键酶之一,介导活化的泛素从结合酶E2转移到底物,不同的泛素连接酶作用于不同的底物蛋白,决定了泛素化修饰的特异性.根据结构与功能机制的不同,可将泛素连接酶E3分为HECT(homologous to E6AP C terminus)家族和RING-finger家族,前者含有HECT结构域,可直接与泛素连接再将其传递给底物.
HEK293细胞极少表达细胞外配体所需的内生受体，且比较容易转染，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。293细胞的一个衍生株：293T/17的转染效率更高，成为广大研究者研究基因功能的一个强大工具。
E6AP作为泛素连接酶（E3）的编码基因利用EYFP标记后可利用免疫细胞化学观察E3在细胞内的表达量及其定位。而E3做为使蛋白质泛素化从而被蛋白酶体降解的重要酶之一，可通过观察E3在细胞过表达从而确定某些蛋白在细胞内的降解状况，对研究细胞损伤有重要意义。
Pmd 19-T Vector是一种高效克隆PCR产物TA Cloning的专用载体。本载体由pUC19载体改建而成,该载体可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。由于本载体以pUC19载体为基础构建而成所以它具有同pUC19载体相同的功能。该载体的beta;-半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，菌落显示的蓝色更深。因此，克隆后更容易进行克隆体的蓝白筛选。
本实验所构建的重组真核细胞表达质粒E6AP-EYFP对于研究硝化应激条件下E3在体内表达的生理、病理作用有一定的意义。相似的方法也可用于生理或病理条件下其他基因作用或者表达变化的研究。
二、研究方法和手段
E6AP是泛素连接酶（E3）的编码基因，该课题通过构建真核细胞过表达质粒E6AP-EYFP，即在目的基因即E6AP中选择合适的位点设计引物，通过PCR方式从cDNA文库中扩增片段并连接至pMD 19-T Vector中进行测序，测序正确后通过酶切、连接得到完整基因序列的目的片段。通过酶切、连接反应插入到载体pEYFPC1中，将该重组质粒转化到Ecoli感受态细胞DH5alpha;中,通过卡纳青霉素抗药性筛选出成功转化的阳性克隆,并进行扩增，再通过酶切验证方法筛选出插入正确的E6AP-EYFP过表达质粒。提取后的质粒通过脂质体转染的方式过表达至HEK293细胞中，并通过ONOO-供体——外源SIN-1刺激，制造硝化应激模型，对E6AP编码的蛋白（E3）在硝化应激条件下的应激反应进行成像检测记录，包括免疫细胞化学、western blot，从而观察E3在硝化应激细胞模型中的表达量和在细胞中定位。同时通过使用细胞器marker，使E6AP-EYFP在细胞中表达后，期望观察到E3和某种细胞器共定位。
- 参考文献：
1. Mortensen F, Schneider D, Barbic T, Sladewska-Marquardt A, Kuhnle S, Marx A, Scheffner M. Role of ubiquitin and the HPV E6 oncoprotein in E6AP-mediated ubiquitination. Proc Natl Acad Sci U S A 2015; 112:9872-7; 26216987; 10.1073/pnas.1505923112
