开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
虫草是类特殊的复型真菌,隶属于麦角菌科、虫草属[Cordyceps (Fr.)Link][1]。虫草主要寄生在昆虫、蜘蛛和某些大团囊菌属(Elaphomyces Nees amp; Fr.)地下种类的子实体上。
多糖是虫草的主要活性成分之一,结构复杂多样,具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降血糖等多种生物活性[2,3],应用前景广阔。国内外的免疫药理学研究结果表明虫草多糖能引起T 细胞、NK 细胞、单核细胞和巨噬细胞的活化、增殖, 并分泌各种淋巴因子[4，5] .虫草多糖主要是通过活化免疫因子和细胞, 促进细胞因子生成等途径对免疫系统发挥双向调节作用。国内外很多研究都表明[6],虫草多糖具有抗肿瘤活性,大多数抗肿瘤作用是非直接杀伤癌细胞,即通过刺激人体非特异性防御机能,在癌症病人经放疗、化疗机体免疫力受损的情况下,与放疗、化疗配合治疗可达到治愈疾病的目的.近年来,通过研究虫草多糖抑制肿瘤基因、降低微核率和诱导肿瘤细胞分化,对虫草多糖抗肿瘤机制的认识不仅仅停留在通过免疫调节抑制肿瘤细胞生长。另外，临床发现，冬虫夏草可降低蛋白尿和延缓慢性肾病发展,保护肾功能。研究发现虫草多糖对多种原因引起的肾损伤均具有保护作用, 能增加肾血流量、改善肾功能、修复肾小管和纠正代谢紊乱。
故研究虫草多糖对人体的作用十分有必要，并且在细胞水平上分析更显得尤为重要。
细胞凋亡（Apoptosis），又称为细胞程序性死亡，是机体在生理或病理条件下，是基因调控下细胞死亡的过程。细胞凋亡在机体发育、细胞增殖与分化、免疫系统的调节等各方面均发挥重要作用。与细胞坏死（Necrosis）引起的细胞无序变化的死亡不同，发生凋亡的细胞胞膜街否仍然完整，无内容物外泄，细胞核固缩，核膜核仁破碎，DNA降解。细胞凋亡是一个非常复杂的级联反应网络体系。细胞凋亡的信号传导通路主要包括三种基本途径。一种是死亡受体介导的外在途径是肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor）超家族的死亡配体引发的。这些配体与细胞表面的死亡受体结合，使受体三聚化并活化，死亡受体三聚体通过死亡结构域募集衔接蛋白，如TNF相关死亡结构域蛋白（TRADD）或Fas相关死亡结构域（FADD）。衔接蛋白通过死亡效应域，与凋亡效应酶如caspase-8或casepase-10结合，形成死亡诱导信号复合体。复合体可启动casepase级联反应，激活下游的效应casepase，诱导细胞凋亡。第二种是由内质网应激所导致的细胞凋亡。内质网应激，如钙离子积蓄和蛋白质聚集，可激活casepase-12进一步剪切casepase-3而诱导细胞凋亡。第三种由线粒体介导的内在途径是以线粒体损伤为凋亡过程的核心。线粒体不仅是细胞有氧呼吸和氧化磷酸化的能量工厂，也是细胞凋亡的调控中心。线粒体是细胞内易受损伤的敏感的亚细胞器，当外源性毒物攻击细胞时，线粒体首先发生病理改变，膜电位下降，通透性转换孔开放，线粒体肿胀，细胞色素C（Cytochromec，Cytc）和凋亡诱导因子（Apoptosis inducing factor，AIF）等促凋亡因子从线粒体膜间隙释放到胞浆中，是启动细胞凋亡的关键步骤。Cytc从线粒体释放后，能与细胞凋亡激活因子1（Apoptotic protease activating factor 1，Apaf-1）以及casepase-8结合，形成凋亡复合物后进一步casepase-9和casepase-3等其他casepase家族成员，从而诱导细胞发生凋亡。此外，线粒体是细胞内合成能量的重要细胞器。细胞的生存、分裂和增殖等生命活动都需要能量，而细胞中能量物质ATP的生产分无氧呼吸（或糖酵解）和有氧呼吸（或氧化磷酸化）两种方式。对于大部分真核细胞而言，线粒体是细胞ATP生成的主要场所。有氧呼吸主要包括三羧酸循环脱氢、线粒体呼吸链电子传递、ADP氧化磷酸化合成ATP三个阶段，这些都依赖于线粒体的正常功能的维持。
肿瘤坏死因子alpha;（tumor necrosis factor alpha;，TNF-alpha;）是一种具有广泛生物学功能的多肽类细胞因子, 参与内毒素性休克、炎症、免疫调节、细胞增生、细胞毒活性和抗病毒等过程。肝脏是体内最大的代谢器官, 线粒体是肝细胞代谢的主要位点。肝脏细胞表面含有丰富的TNF-alpha;受体, 是其作用的主要靶器官。研究发现TNF-alpha;能引起细胞线粒体损伤，抑制线粒体的呼吸功能并增加线粒体活性氧（reactive oxygen species，ROS）和过氧化脂质的形成[7,8]。线粒体功能障碍导致的ROS产生增加在人类各种肝脏损伤性疾病中都能被观察到。线粒体既是ROS形成的主要部位, 也是ROS攻击的首要靶点。研究证实TNF-alpha;能诱导各种类型细胞ROS的生成[9-11]。
线粒体融合蛋白基因2(mitofusin-2 gene,Mfn2)能促进线粒体的融合,与线粒体形态、结构和功能有着密切联系[12]。Mfn2是我国学者陈光慧利用差异显示技术得到的一个新基因,研究发现,TNF-alpha;可以显著抑制肝细胞Mfn2基因的转录与表达,且TNF-alpha;能显著抑制肝细胞ATP生成水平并大量诱导ROS生成,但转染Mfn2基因后能显著抑制这一过程,说明TNF-alpha;可通过抑制Mfn2基因导致线粒体功能损伤[13]。
虫草多糖对肝脏的保护作用主要包括保护化学性肝损伤、免疫性肝损伤及肝纤维化等。目前多数认为虫草多糖对肝脏的保护作用主要是通过抗脂质过氧化、改善人体细胞和体液免疫功能，以及增强肝细胞的吞噬能力，并且越来越多的研究表明在各种氧化应激引起的细胞损伤过程中，虫草及其单体成分具有抗氧化活性，能增强SOD的活性，增强氧利用率，促进ATP形成，能够增强活性氧消除能力等[14]作用表明虫草及其单体成分与线粒体的作用具有一定的关系。肝星状细胞(hepaticstellatecells，HSC)是肝纤维化细胞外基质过多产生和沉积的主要来源，其激活是肝纤维化发生的关键，而核转录因子kappa;B(NF-kappa;B)在激活HSC中起重要作用，NF-kappa;B促进TNF-alpha;生成同时也被TNF-alpha;激活。越来越多的研究表明，虫草多糖对于化学性肝脏损伤、免疫性肝损伤均有保护作用。
本次实验主要选取虫草多糖的CPS-A活性片段，构建L02肝细胞线粒体氧化损伤模型，通过其相关蛋白的表达差异，观察并研究虫草多糖对线粒体氧化损伤的肝L02细胞的保护作用。
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