开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 背景
炎症小体（一种多蛋白胞浆复合物）的激活，会导致caspase-1的激活，也因此导致炎性细胞因子IL-1beta;and IL-18.的分泌成熟。NLR组（核苷酸结合结构域，富含亮氨酸重复序列）或者非NLR组，连同其衔接蛋白ASC，一起组装形成因个体不同而不同的炎症小体复合体。虽然配体的激活以及几种炎症小体（NLRP1, NLRC4 and AIM2）的激活机制已经被知悉，但目前尚不清楚其他炎症小体如何被激活，尤其NLRP3炎性小体是在分子水平上被激活的。一系列不同的外源性和内源性激动剂可以激活NLRP3炎性小体，然而这些配体与NLRP3结合的机制尚不清楚。按照这个概念，最近的研究表明，一些细胞应激相关的信号通路会导致NLRP3激活。这些信号包括内质网应激，钙信号和线粒体相关信号包括mROS，心磷脂和线粒体DNA。自从炎症小体能够诱导Caspase蛋白酶被阐述清楚后，它在生物和临床上影响的越来越大。未来对于炎症小体新的激活介导体的鉴定能够提供针对多种疾病的潜在的治疗靶点。
- 拟研究问题：
- 1. 探究DMF及其肠道代谢产物MMF对NLRP3炎症小体激活的作用。
- 2. 探究DMF及MMF对抑制NLRP3炎症小体激活的具体机制。
- 3. 探究Nrf2-ARE信号通路与NLRP3炎症小体信号通路的关系。
- 研究手段
- （1）药效研究
- 1.在人单核巨噬细胞THP-Ms中预先给予一定浓度的DMF和MMF,再给予炎性刺激，Western blot检测炎症小体各组分的变化，Elisa检测IL-1beta;的分泌。
- 2.在人单核巨噬细胞THP-Ms中预先给予一定浓度的DMF和MMF,再给予炎性刺激，real time RT-PCR检测细胞中NLRP3，Pro-IL-1beta;基因水平的表达。
- 3.在人单核巨噬细胞THP-Ms中预先给予一定浓度的DMF和MMF,再给予炎性刺激，免疫荧光观察ASC聚合体的形成。
- (2)机制研究 (探究Nrf2-ARE和NLRP3炎症小体间的Crosstalk)
- 1.分别在野生型以及Nrf2敲除小鼠中提取骨髓分化的巨噬细胞（BMDM), 分别检测DMF与MMF对NLRP3炎症小体激活的抑制作用。
- 2. 不同浓度的MMF,DMF 刺激细胞后，采用流式技术检测细胞内活性氧的变化，线粒体膜电位损失程度，以及胞浆线粒体DNA的释放情况。
- 2. 外源性降解胞浆线粒体DNA，再给予DMF,MMF,及炎性刺激检测炎症小体各组分的变化。
(3)方法手段
1)Western blot:提取蛋白、电泳分离样品，结束后转移至硝酸纤维素膜，用BSA封闭，分别与不同一抗反应，再和二抗反应，曝光、显影、定影，进一步分析蛋白表达水平的变化。
- 2)real time RT-PCR:提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo dT或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
3)免疫荧光：根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物（ASC)，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位。
4)流式技术：THP-Ms贴壁并经不同刺激处理后，PBS洗2遍后，用含0.25% Trypsin消化液消化细胞，室温下消化1-2 min，立即倒去消化液，加入10%胎牛血清的1ml 1640培养液终止反应，轻轻吹打之形成细胞悬液，用移液器移入1.5ml tube管中，1500 rpm离心5min后，弃去培养液，PBS洗2遍后，1500rpm离心10min，每个样中加入1.5ml 浓度为5 mu;M 的DCF工作液，于37℃避光孵育30 min。孵育完毕后，1500 rpm离心10 min，小心弃染色反应液，每孔加入 200 mu;l PBS 清洗 2 次，每次离心5 min，后再用200 ul PBS重悬细胞。半小时内用BD小型流式细胞仪FL1通道检测10000 个细胞中细胞的荧光信号值，得出峰移曲线（细胞内ROS多时，荧光信号强，峰右移），进而测定细胞内线粒体ROS水平。
5）收集经各种刺激后的细胞上清，严格按照Elisa 试剂盒进行，以空白调零，450 nm 波长依次检测各孔吸光度。
文献综述： Nrf2及氧化应激与Nlrp3的关系
摘要：延胡索酸家族的代表药物，富马酸二甲酯，及单甲酯作为Nrf2激动剂，可以诱导Nrf2入核，激活下游的抗氧化基因，清除活性氧等有害物质，保护细胞。而活性氧积累诱导线粒体的损伤，激活NLRP3炎症小体。如今，内源性调控NLRP3炎症小体机制已成为研究热点，而Nrf2-ARE 与NLRP3 炎症小体信号通路的Crosstalk 更值得探究。
