- 研究背景
双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶（DYRK）属于CMGC家族，CMGC家族包括细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、糖原合成酶激酶（GSK）以及CDK样激酶（CLKs）[1]。DYRKs在进化上高度保守，其主要功能是使靶蛋白磷酸化，同时具有调节细胞存活、分化、增殖和凋亡的功能。双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶2 (dualspecificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 2, DYRK2) 是DYRKs家族的成员之一,主要分布于细胞质中，有研究认为其主要功能与细胞功能的多重效监管有关。DYRK2的主要功能是GSK3的启动激酶，DYRK2通过磷酸化p53来响应DNA损伤，是细胞周期和凋亡的关键调控因子[2]可以直接作用于其底物cJun和c-Myc从而参与细胞周期的调节。
研究发现，DYRK2可以直接磷酸化蛋白酶体中ATP酶RPT3亚基的保守的25位的苏氨酸，从而增强26S蛋白酶体活性, RPT3上的Thr25位点被认为是加强亚基向20S蛋白酶体核心移位的关键位点，能够引发蛋白质降解。研究人员证明了DYRK2的缺失会损害蛋白酶体活性从而导致参与不同细胞过程的蛋白质的大量堆积。在小鼠异种移植模型中，这些DYRK2缺失的细胞显示出缓慢的增殖速率以及显著地减少癌症负担[3]。
本课题将首先通过大肠杆菌表达并分离纯化得到DYRK2蛋白。随后将待筛选化合物与其进行分子互作研究，筛选出对该激酶的相应抑制剂。进一步对筛选出的抑制剂与DYRK2蛋白进行共晶，优化结晶条件，得到并解析其晶体结构。通过分析验证抑制剂与DYRK2的构效关系，为后续的结构修饰以及药物的研发提供参考依据。
- 研究意义
越来越多的研究从凋亡、增殖、EMT、干细胞等方面揭示了DYRK2的分子机制，我们确定DYRK2基因是一种重要的肿瘤抑制因子的候选基因。DYRK2是对蛋白酶体抑制剂耐药或适应的癌症具有潜在抗癌作用的分子靶点[4]。因此针对DYRK2设计特异性的抑制剂，将成为抗癌药物开发的一个新的思路。本课题将探究蛋白激酶抑制剂对DYRK2的选择性以及抑制作用的强弱。获得抑制剂分子与DYRK2蛋白共晶结构，并进行X射线衍射，解析其结构为后续的抑制剂结构的进一步优化修饰奠定基础。为对蛋白酶体抑制剂耐药或适应的癌症的抗癌药物的开发提供数据支持。
- 研究进展
目前已完成了对DYRK2蛋白进行重组构建使其异源表达，以及第一批DYRK2蛋白的分离纯化，以及第一批蛋白与抑制剂共晶条件的初筛。
- 研究内容
1. DYRK2质粒的构建与表达
用于纯化DYRK2核酸内切酶的载体是通过PCR构建，并在构建体N末端插入六个组氨酸标签，用于Ni柱的分离纯化。
将PCR产物分别上1%琼脂糖胶，切胶纯化，用Nanodrop在260nm下测定其浓度。将所得质粒进行酶切验证，确认正确后，分别转化入E.coli BL21中，涂板划线后，在37℃培养箱培养过夜。用已灭菌的牙签蘸取单克隆菌落，加入100ml 相应抗性的LB 培养基中培养过夜。
次日，取浑浊的100ml LB 培养菌液转移至12瓶1000ml 相同的LB培养基并加入1 mL卡那霉素后培养。
2. DYRK2蛋白的纯化
