异香豆素B对实验性肠炎小鼠的治疗作用文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一、课题解决的问题

本课题通过建立DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎（UC）模型，考察异香豆素B对实验性肠炎小鼠的治疗作用，并通过检测结肠组织中炎症因子的表达进一步验证异香豆素B的抗UC作用。为扩大异香豆素B的开发利用提供理论依据，也为研究新的UC治疗药物提供思路。

建立DSS诱导的小鼠结肠炎，需考虑到多种影响因素，应熟练掌握建模方法，避免人为误差才能更好的进行后续研究。同时，需熟练掌握ELISA、Q-PCR等实验方法。

二、研究方法和技术路线

研究方法

采用2.5%的DSS复制小鼠UC模型，灌胃给予异香豆素B（20, 50 mg/kg），连续10天；

建模后，每天进行小鼠体重称量，腹泻程度以及是否便血测定，进行DAI评分计算；

末次给药后处死小鼠，取结肠，观察结肠外观性状并测量拍照，并剪取一部分进行固定再用石蜡包埋切片，HE染色后于显微镜下观察其病理损伤程度；

称取适量结肠组织按MPO试剂盒说明书操作，检测结肠组织中MPO活力；

称取适量结肠组织采用Q-PCR法检测前炎因子IL-1beta;、TNF-alpha;、及IL-6 mRNA水平；

称取适量结肠组织采用ELISA法检测前炎因子IL-1beta;、TNF-alpha;、及IL-6蛋白水平；

技术路线

三、研究计划

2017年2月27日---3月22日 查阅文献，确定选题，撰写开题报告

2017年3月23日---4月13日 建立DSS诱导的小鼠UC模型，DAI评分和结肠长度测定

2017年4月14日---4月20日 结肠组织中MPO活力检测

2017年4月21日---5月10日 采用Q-PCR法检测结肠组织中前炎因子mRNA水平

2017年5月11日---5月25日 采用ELISA法检测结肠组织中前炎因子蛋白水平

2017年5月26日---6月08日 撰写论文、完成答辩

四、文献综述

炎症介质在溃疡性结肠炎中的调控作用

摘要：

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）是一种慢性炎症性疾病。其病变部位主要是直肠以及结肠，且病程漫长、易反复发作。虽然UC的发病机制尚未完全明确，但目前认为UC的发病主要涉及遗传、感染、免疫异常、粘膜屏障破坏等因素，其中肠道免疫异常与UC的发生发展密切相关。介导免疫炎症反应的物质主要是炎性细胞以及各种炎性介质，比如肿瘤坏死因子、干扰素、白介素等。本文就部分炎症介质在溃疡性结肠炎中的调控作用进行如下综述，为进一步探究溃疡性结肠炎的具体的发病机制提供指导。

关键词：炎症介质；溃疡性结肠炎

正文：

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）是一种慢性自发性的肠道炎性疾病，属于炎症性肠病（inflammatory bowel diseases, IBD）。它的发病特点为粘膜炎症反复发作，病变开始于直肠并不断向结肠近端蔓延，严重者可至回肠。临床上表现一般包括腹痛、腹泻、粘液血便、里急后重等，病情严重者还会出现发热和体重减轻^{[1, 2]}。临床上常用于诊断溃疡性结肠炎的方法主要包括内窥镜检查术和组织学检查^[3]。用于临床的治疗药物主要有以下几种：①氨基水杨酸类（5-ASAs），包括美沙拉嗪、柳氮磺胺吡啶等，常用于治疗轻中度的溃疡性结肠炎，且氨基水杨酸盐和局部用药联合治疗更有效。②皮质类固醇类，包括强的松龙、氢化可的松等，常用于治疗5-ASAs难以治愈的轻中度溃疡性结肠炎，它和5-ASAs同为溃疡性结肠炎的基础治疗药物。③免疫抑制剂，包括甲氨喋呤、6-巯基嘌呤等，常用于治疗中重度的溃疡性结肠炎。④生物制剂，直接进行靶向治疗，在诱导、维持溃疡性结肠炎缓解以及防止并发症方面比其他种类的药物更有优势。常用的生物制剂包括英夫利昔单抗（Infliximab,IFX）、阿达木单抗（Adalimumab,ADA）等。

UC的发病无性别差异，在全世界范围均有发生，但高发人群主要集中在30-40岁，且发病率逐年增加^[4]。UC严重影响患者的身体健康和生活质量，且有致残以及癌变倾向，已被世界卫生组织（worldhealth organization, WHO）列为现代难治病之一^[5,6]。已报道的UC最高发病率在北欧，约为百万分之24.3，其次为加拿大、澳大利亚以及美国等^[7,8]。目前发展中国家关于UC的可用流行病学数据还比较少，但无论是亚洲、中东还是南美对UC的认识都在不断增加^[9]。溃疡性结肠炎的发病受多种因素的影响，包括遗传因素、粘膜屏障的破坏、免疫反应失调以及环境因素等^[3]。虽然目前关于溃疡性结肠炎的具体发病机制还不是十分明确，但是有研究表明溃疡性结肠炎的发生与机体的免疫系统的失调有密切关系，比如炎症介质在溃疡性结肠炎发病过程中的调控作用。

1. 白介素1beta;（IL-1beta;）

IL-1beta;主要由巨噬细胞产生，可以反作用于T淋巴细胞、巨噬细胞，促进IL-2、IL-6、TNF-alpha;等炎症因子的释放，从而导致炎症的暴发^[10]。在UC患者体内IL-1beta;与抗原协同作用增强肠粘膜屏障保护，从而活化T细胞，呈递抗原、释放炎症介质。同时还能促进巨噬细胞产生炎症因子，包括TNF-alpha;、IL-6、IL-8等，导致更多的中性粒细胞在炎症部位聚集，从而加重肠道炎症反应^[11]。侗药五味止泻汤灌胃给予TNBS 乙醇诱导的结肠炎大鼠后发现，大鼠血清中IL-1beta;水平明显减少，而IL-10在血清中的含量明显升高，结肠粘膜损伤指数明显降低。由此可以说明侗药五味汤可能通过促进IL-10的表达，抑制IL-1beta;的生成，改善机体内促炎症细胞因子和抑炎症细胞因子之间的失衡，发挥治疗溃疡性结肠炎的作用^[10]。

白介素6（IL-6）

IL-6主要由活化的上皮细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等产生^[11]。可以促进B淋巴细胞的活化、增殖、分化以及促进合成免疫球蛋白等。IL-6的过度表达导致机体稳态失调、内皮细胞肿胀、上皮细胞分泌的电解质减少、细胞膜的通透性增加，使得更多的中性粒细胞浸润炎症部位^[12]。IL-6还可以通过STAT-3信号途径使得NF-kappa;B被激活从而上调细胞间黏附分子（ICAM-1）的表达水平，同时也使得中性粒细胞间黏附作用加强^[13]。卢义涛等^[14]研究发现，活动期的UC患者体内IL-6水平明显高于正常人。有研究报道，沙利度胺降低UC模型大鼠血清内IL-6水平^[15]。同时，沙利度胺可以显著降低实验性结肠炎大鼠结肠组织中基质金属蛋白酶(MMP)-9、环氧合酶(COX)-2的表达，抑制炎症反应保护粘膜屏障发挥抗UC效应。

3. 白介素8（IL-8）

IL-8主要由纤维母细胞、单核细胞、巨噬细胞等产生的，它是中性粒细胞的趋化以及活化因子，具有趋化和激活中性和嗜碱性粒细胞的功能^[16]。同时，IL-8也可以由人体内的多种肿瘤细胞来表达，比如鳞状细胞癌、黑素瘤和甲状腺癌等。而肝癌细胞、星状细胞癌、肾细胞癌等需要在IL-1或TNF-alpha;等细胞因子的刺激下才能合成和分泌IL-8^[17]。有研究显示，IL-8能够与中性粒细胞表面的特异性受体结合，激活中性粒细胞并使得中性粒细胞爆发，生成超氧化物促进白三烯B4、溶酶体^[17]、组胺等分泌。与此同时，许多有毒的物质也会随之释放，进一步加重炎性反应、诱导组织损伤^[17]。研究表明，人体内血清中的IL-8的高表达水平与许多炎症介质介导的炎症反应有密切联系，比如IL-6。UC患者的结肠粘膜以及外周血中IL-8高表达，并随着炎症程度的加深而增加^[18]。IL-8在UC中主要是通过趋化和激活中性、嗜碱性粒细胞来促进炎症反应的发生^[19]。地塞米松作为皮质类固醇类抗UC的基础药物，是IL-8受体的竞争性或非竞争性阻断剂，阻断IL-8与IL-8受体的结合，减少中性粒细胞游走从而抑制其发挥作用^[17]。

4. 白介素9（IL-9 ）

IL-9由新发现的Th9（CD4 T细胞亚群）细胞产生，同时IL-9的产生也需要复杂的细胞因子微环境^[19]，比如IL-4、TGF-beta;、IL-21是其刺激剂促进它的产生，而IFN-gamma;则抑制其产生^[20]。IL-9与IL-9受体结合后，通过特异性受体激活janus激酶（JAK）信号转导和转录激活因子（STAT）信号通路控制靶细胞中的基因表达，发挥促炎症作用^[21]。有研究表明，IL-9可以在一定条件下诱导Th17分化,同时IL-9也参与调节肠道屏障功能，促进炎症的发生^[20]。IL-9可以通过不同的紧密连接分子影响肠组织屏障的性质，使构成上皮细胞间的紧密连接的结构性蛋白表达谱发生变化导致肠粘膜通透性增加，进而引起肠道菌群易位，扩大炎症反应，影响溃疡愈合^[22,23]。抗IL-9抗体，已在和葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎小鼠和UC患者中进行了药效评估。腔注射抗IL-9抗体后，检测结肠组织中用转录因子PU.1标记的Th9细胞，发现位于发炎的固有层中的PU.1阳性Th9细胞的密度在显著增加。由此说明抗IL-9抗体中和IL-9信号，从而发挥抗结肠炎症作用^[20]。

5. 白介素17（IL-17）

IL-17主要由Th17细胞产生，是UC中主要的致炎因子之一。IL-17可以募集、激活嗜中性粒细胞，诱导活化T细胞、巨噬细胞、上皮细胞等产生多种促炎介质，包括IFN-gamma;、TNF-alpha;、IL-6等，以此诱导肠粘膜炎症的发生^[24-26]。IL-17是多效细胞因子，还可以通过丝裂原活化蛋白激酶通路（MAPK）诱导IL-6和IL-8的生成。从而招募更多嗜中性粒细胞聚集在炎症部位，触发T细胞增殖和上调多种促炎因子水平，例如iNOS和IL-1beta;。此外，IL-17诱导巨噬细胞产生促炎细胞因子，创造了一个在先天和适应性免疫之间的联系，发挥宿主在粘膜表面防御细菌的关键作用^[27]。研究发现丁酸盐通过降低血清和结肠粘膜中的IL-17水平，改善结肠炎大鼠病变，且在人体静脉单核细胞和大鼠脾细胞中也观察到丁酸盐抑制IL-17产生。在健康状态下Treg细胞和Th17细胞之间存在良好的平衡，Treg通过产生抗炎细胞因子对Th17发挥负调节作用。但UC患者免疫异常，Treg/Th17平衡被破坏，丁酸盐通过调节Treg和Th17之间的平衡来发挥抗UC作用[28]。

6. 肿瘤坏死因子（TNF-alpha;）

TNF-alpha;主要由T细胞、单核细胞、巨噬细胞分泌。在正常机体中的作用是维持机体免疫平衡，对抗感染，监视、抑制肿瘤生长。但在UC患者中过度生成，导致一系列伤害机体的反应产生，包括刺激巨噬细胞、内皮细胞、纤维母细胞、平滑肌细胞等产生细胞因子、蛋白酶、花生四烯酸代谢物促进炎症反应；刺激胃肠细胞吞噬补体片段诱发坏死、加速肠粘膜的凋亡破坏粘膜屏障；破坏间质蛋白、增加局部水肿；协助干扰素改变肠粘膜屏障的结构、特点、通透性，加速UC从缓解期转向活动期。同时研究表明，血清中TNF-alpha;水平与UC的严重程度紧密相关，降低血清中TNF-alpha;水平可明显缓解UC^[29]。

目前临床上常用的生物制剂就是抗TNF-alpha;抗体。IFX是TNF-alpha;的嵌合单克隆抗体。ACT1/ACT2实验显示，IFX在临床反应、临床缓解、粘膜愈合方面均显著高于安慰剂，是最早用于UC临床治疗的生物制剂。ADA是新一代针对TNF-alpha;的人源单克隆抗体，主要用于类固醇或免疫调节剂治疗失败的患者，发挥诱导和维持缓解期的作用。在ULTRA2和ACT2实验中，IFX和ADA作用效果均优于安慰剂。与治疗52周相比，在治疗8周时IFX在诱导缓解和粘膜愈合方面比ADA更有效，而且在治疗中重度UC患者时，IFX成本花费更低^[30]。

在溃疡病结肠炎中发挥促炎作用的因子有很多，比如IL-2、IL-13、氧自由基、NO、C反应蛋白（CRP）等。这些因子之间相互作用、相互调节，维持机体的正常发展，而当机体发生免疫异常时，就会导致炎症反应的反生，进一步刺激炎症细胞分泌释放炎症介质，诱发并加重炎症。了解炎症介质在溃疡性结肠炎中的具体作用，有利于进一步探究溃疡性结肠炎的作用机制，并且也为生物制剂的靶向治疗提供指导。

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