开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
1. 拟研究的问题：
Lipopolysaccharide (LPS)，也称为内毒素，是革兰氏阴性细菌细胞壁的组成部分，是体内和体外炎症反应的有效触发因素。向动物腹膜内或静脉内注射大剂量LPS会诱导巨噬细胞全身性产生炎性细胞因子，包括TNF-a，IL-1beta;和IL-6 [1-4]。反过来，这会导致组织损伤，体温失调甚至致死。因此，注射高剂量的LPS已被用作败血性休克的实验模型。但是，向动物注射低剂量（亚致死剂量）的LPS可能会导致“LPS耐受”状态，从而改变随后对LPS或其他炎症刺激的反应。
内毒素耐受(endotoxin tolerance)早在50多年前就已经引起人们的关注,但其具体的分子机制至今尚不清楚。Toll样受体4(Toll-like receptor-4,TLR4)作为脂多糖(LPS)的主要受体,参与LPS信号的跨膜转导,与LPS耐受密切相关。在内毒素耐受过程中,TLR4转导通路中的信号蛋白及下游转录因子在数量、结构和功能上发生改变,可引起炎性因子释放减少、抗炎因子产生增加,并导致特定信号通路(如PI3K通路)和负性调节因子(如SHIP1、SOCS、FLN29等)的激活。除此之外,TLR2通路、G i蛋白、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)以及一些信号分子的剪接异构体等也参与了内毒素耐受现象的发生。总之,内毒素耐受是一个由多种原因引起的、多种生物物质参与的复杂病理生理过程,是机体抵抗革兰氏阴性细菌感染的重要保护机制。因此,探索内毒素耐受的机制,寻求机体内源性的抗炎机制将为败血症等一些致死性感染性疾病的治疗提供新的思路和理论依据。我们尽管对LPS耐受性有很大的临床兴趣，但仍无法确定解释其作用的统一分子机制。目前已经确定了多种机制，可能为临床治疗提供新的见解。
免疫应答基因1（IRG1）于1994年被克隆为LPS诱导的基因，被发现在胚胎着床和神经退行性变中起重要作用。除了关于通过LPS刺激，禽分枝杆菌亚种副结核菌感染，肺炎衣原体（GEO基因芯片数据，GDS2651、25），酵母菌（GEO基因芯片数据）诱导表达的报道外，其在先天免疫反应中的生物学功能仍然未知[5-9]。在自身免疫或炎性疾病中也发现IRG1表达失调，因此，IRG1被认为与炎性自身免疫疾病的发病机理有关。在这项研究中，我们构建了IRG1敲除的C57BL/6小鼠，提取BMDMs细胞，建立LPS耐受模型，借助代谢组学的手段阐明IRG1在免疫耐受中的作用机制。
2．研究内容及方法：
2.1 BMDMs细胞的提取
首先取C57BL/6小鼠，用颈椎脱臼法将它们处死。要注意在整个实验过程中使用的均为无菌手术器械，用75％酒精消毒小鼠皮肤，然后在每条后腿的顶端做一个切口，将皮肤向下拉向足部，露出肌肉。切断后腿将之分离，用无菌的剪刀和镊子取出皮肤，并将腿放在含有适量预冷的无菌PBS的培养皿中。用无菌的剪刀和镊子摘除粘在骨头上的肌肉，将骨转移到新的无菌培养皿中。用无菌的剪刀将骨关节腔剪开，然后用10ml预冷的无菌PBS将骨髓冲入50ml无菌的离心管中，重复此步骤两次。将骨髓液用200 mu;m滤膜过滤以去除残渣，将滤液在4℃下以500times;g离心10分钟。缓缓倒去上清液，将细胞沉淀用适量的红细胞裂解缓冲液裂解30秒，在4℃条件下以500times;g离心3分钟，重复上述步骤两次。缓缓倒去上清液，用适量37 ℃的完全DMEM把细胞沉淀物吹散，然后将细胞均匀地铺入培养皿中，并加入M-CSF细胞因子使其终浓度为25ng/ml，放入细胞培养箱中进行培养。培养三天后，去除上清液，然后用PBS洗涤BMDMs细胞2次，加入新鲜的含25ng/ml的M-CSF的DMEM培养基继续培养三天，则该细胞分化为M0型巨噬细胞。
2.2免疫耐受模型的建立
待BMDMs细胞分化为M0型巨噬细胞后，加入100ng/ml的LPS刺激BMDMs细胞，放入孵箱中继续培养12小时，将细胞的培养基丢弃，换为新鲜的含100ng/ml LPS的培养基，再继续培养12小时，即模型构建完成。
