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开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字） 课题来源：自拟课题 课题依据： 中药黄芩是《中国药典》收载的常用中药，为唇形科多年生草本植物黄芩的干燥根。黄芩性味苦寒，具有清热燥湿、解毒止血、安胎之功效，主治热病，用于肺热咳嗽、发烧感冒、急性痢疾、胃肠炎、痈肿疮毒、头痛、目赤肿痛等症。汉黄芩素即为黄芩中的主要成分之一。近年来，国内外研究人员从不同方面对汉黄芩素的抗癌作用和作用机制进行了深入的研究，发现汉黄芩素对肿瘤细胞的杀伤作用有其独特的机制。 脂多糖（LPS）作为革兰氏阴性菌细胞壁的成分，是一种重要的炎性因子，参与多种炎症反应。有文献报道，LPS可以诱导炎症反应中血管通透性的变化，从而促进炎症反应的持续进行。本课题拟利用几种常见的体内外血管通透性研究模型（内皮细胞迁移实验、细胞骨架染色实验、跨内皮迁移实验和MILES实验）来考察汉黄芩素对LPS诱导血管通透性的影响，为揭示汉黄芩素抗炎作用提供一定的理论依据。 主要解决的问题:本课题中我们利用几种LPS诱导血管内皮细胞通透性的模型来探讨汉黄芩素对LPS诱导的血管通透性的影响。 血管通透性是指血管内各种物质通过的能力，正常生理条件下，水和电解质可通过毛细血管屏障进入组织间隙，白蛋白等大分子物质不能通过毛细血管屏障进入组织问隙，但在某些情况下，如严重的感染、创伤等某些突发因素可使单核-巨噬细胞系统、内皮细胞和中性粒细胞过度激活，使炎性细胞因子释放并介导免疫反应，毛细血管内皮细胞损伤，细胞连接分离、出现裂隙，经毛细血管运输通道的孔径增大、血管通透性增高。血管通透性受多种因素的调节，如血浆白蛋白水平、炎症递质、血小板激活因子、蛋白激酶G、内皮细胞黏附分子、细胞间黏附分子、一氧化氮、冲击波、氧分压和血氧饱和度、凝血酶及氧化剂等。 本课题从体内外来研究汉黄芩素对LPS诱导的血管通透性的影响。
HUVECs接种于24孔板中，待密度达到70%时给予汉黄芩素（0、1、10和100 mu;M）处理4 h（具体给药方式如图所示）。消化细胞，用无血清培养基稀释配比成相同浓度的细胞悬液（5 times; 105个/ml）。取Transwell小室与24孔板中，每组取上述细胞悬液400 mu;l加入Transwell小室上室中，下室加入LPS（0或1 mu;g/ml）。37°C、5% CO2培养箱中孵育4 h后，取出Transwell小室，用棉签轻轻擦去微孔滤膜内侧未穿过的细胞，用100%甲醇固定滤膜2 min，苏木精染色3 min，伊红染色30 s。最后用水冲洗，棉签擦干，随机于显微镜下取上、下、左、右、中心共5个视野，计算细胞迁移的平均数。比较对照组与各给药组数据，判断药物作用。实验重复3次。所得数据使用SPSS分析软件进行one-way ANOVA分析。
HUVECs接种于盖玻片上，待细胞汇合后加入不同浓度（0、1、10和100 micro;M）的汉黄芩素处理4 h。然后分别用0或1 mu;g/ml处理细胞1 h。取出盖玻片，置于六孔板中。PBS缓慢摇晃清洗3遍，每遍5 min。加入2 ml 4%多聚甲醛固定20 min，PBS缓慢摇晃清洗3遍，每遍5 min。0.2% Triton X-100透化10 min，PBS缓慢摇晃清洗3遍，每遍5 min。1% BSA封闭1 h。PBS缓慢摇晃清洗3遍，每遍5 min。FITC标记Phalloidin用PBS稀释至工作液浓度（1:30），室温孵育1 h。PBS缓慢摇晃清洗3遍，每遍5 min。DAPI染细胞核20 min。PBS清洗3遍后，取出，封片。避光干燥。激光共聚焦显微镜拍摄。
消化细胞，将混匀的HUVECs稀释重悬，浓度为1 times; 104个/ml。取出Transwell小室，放入细胞培养板中（24孔板），每组取上述细胞悬液400 mu;l加入上室中。放入细胞培养箱中孵育，待细胞汇合后，加入不同浓度（0、1、10和100 micro;M）的汉黄芩素处理4 h。然后分别用0或1 mu;g/ml处理细胞1 h。PBS清洗，取MDA-MA-231细胞，消化，用无血清培养基稀释配比成相同浓度的细胞悬液（5 times; 105个/ml）。每组取上述细胞悬液400 mu;l加入上室中，下室加入全血清培养基600 mu;l。37°C孵育4 h后，取出Transwell小室，用棉签轻轻擦去微孔滤膜内侧未穿过的细胞，用100%甲醇固定滤膜2 min，苏木精染色3 min，伊红染色30 s。最后用水冲洗，棉签擦干，随机于显微镜下取上、下、左、右、中心共5个视野，计算细胞迁移的平均数。比较对照组与各给药组数据，判断药物作用。实验重复3次。所得数据使用SPSS分析软件进行one-way ANOVA分析。
取雄性BALB/c小鼠，按处理因素随机分成溶剂对照组，LPS对照组和汉黄芩素给药组（20、40、80 mg/kg）共5组，每组七只。汉黄芩素给药组小鼠尾静脉注射（i.v.）给药，连续给药六天。尾静脉注射1% 伊文思蓝溶液100 mg/kg。20 min后，LPS对照组和汉黄芩素给药组均经背部皮肤注射LPS 10 mu;l（0.2 mg/ml），空白对照组给予同等体积的生理盐水。20 min后处死小鼠，取下背部蓝染皮肤。以蓝斑部位大小表示渗透强弱。
（1）收细胞：HUVECs接种于细胞培养皿中，待密度达到70%时给予汉黄芩素（0、1、10和100 mu;M）处理4 h，然后分别用0或1 mu;g/ml处理细胞1 h（具体给药方式如图所示）后，1000 rpm离心收集细胞。 （2）提蛋白：用冷PBS洗两次，尽量弃去残余的PBS。用适量体积冷细胞裂解液或者磷酸化裂解液（62.5 mM Tris-HCl [pH 6.8]，2% wt/vol sodium dodecyl sulfate [SDS]，10% glycerol，50 mM dithiothreitol（DTT），0.01%溴酚兰）重悬细胞，冰上放置40 min，充分裂解细胞。将细胞裂解液4C 13000 rpm 离心10 min，上清液为抽取的总蛋白。用BCA法测定蛋白含量，并稀释成相同的浓度。然后将同等总蛋白量的不同处理样品按1:3与4times;loading buffer混匀，沸水浴变性5 min后，与－20C保存。 （3）制胶和电泳：制备10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，80 V浓缩胶，120 V分离胶，2.5～3 h。 （4）转膜：电泳后取下胶，按尺寸剪取合适大小的Whatmann滤纸及硝酸纤维素膜，上下各一层滤纸，中间为胶和膜，胶在负极，膜在正极，用玻棒仔细赶除气泡，采用半干式转膜，恒压20 V，时间根据相应的蛋白KD数进行调整，转移蛋白到硝纤膜。 （5）丽染和封闭：将转入蛋白的硝纤膜浸入丽春红工作液中，染色2～5 min后，蒸馏水冲洗，观察转膜效率，标记蛋白，用PBST洗去。丽春红条带。用10%脱脂奶粉，37C封闭1 h。 （6）抗体孵育：弃封闭液，用少量PBS将残余奶粉漂洗干净，封口机将各条膜封闭于自封袋中，尽可能排除气泡。一抗用PBST稀释至工作液浓度，37C恒温摇床反应1～2 h，4C孵育过夜；用PBST清洗5次，6 min/次。用PBST稀释二抗至工作液浓度，按前法封袋，37C恒温摇床反应1 h。反应结束后弃二抗，用PBST清洗5次，10 min/次。 （7）扫描结果：PBS清洗2次，6 min/次；用Odyssey近红外荧光扫描成像系统扫膜。 参考文献 [1]Song, X., Y. Zhou, M. Zhou, Y. Huang, Z. Li, Q. You, N. Lu, and Q. Guo, Wogonin influences vascular permeability via Wnt/beta-catenin pathway. Mol Carcinog, 2013. [2]任晓东,符 伟,张晓芸,胡 珀,汪 嵘, 李志裕 天然产物汉黄芩素的研究进展 [3]明 佳,袁侨英,周 艳,苟元彬,刘良明，体外LPS诱导血管内皮细胞通透性改变及其与连接蛋白43的关系 [4]孟淑静，曹春蕊，任艳焕，马冬雪 ，血管通透性及其相关因素研究进展 [5]严静怡，陈宝安 汉黄芩素的提取及抗肿瘤的作用机制 |
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附录 综述 血管通透性及其影响因素 1血管通透性 血管通透性是指血管内各种物质通过的能力，正常生理条件下，水和电解质可通过毛细血管屏障进入组织间隙，白蛋白等大分子物质不能通过毛细血管屏障进入组织问隙，但在某些情况下，如严重的感染、创伤等某些突发因素可使单核-巨噬细胞系统、内皮细胞和中性粒细胞过度激活，使炎性细胞 子释放和介导免疫反应参与，毛细血管内皮细胞损伤，细胞连接分离、出现裂隙，经毛细血管运输通道的孔径增大、血管通透性增高。血管通透性受多种 素的调节，如血浆白蛋白水平、炎症递质、血小板激活凶子、蛋白激酶G、内皮细胞黏附分子、细胞间黏附分子、一氧化氮、冲击波、氧分压和血氧饱和度、凝血酶及氧化剂等。 2 血管通透性的调节因素 2.1血浆渗透压水平。血浆胶体渗透压主要由蛋白质分子构成，其中，血浆白蛋白分子量较小，数目较多(白蛋白gt;球蛋白gt;纤维蛋白原)，决定血浆胶体渗透压的大小。由于组织液中蛋白质很少，所以血浆的胶体渗透压高于组织液。在血浆蛋白中，白蛋白的分子量远小于球蛋白，故血浆胶体渗透压主要来自白蛋白。若白蛋白明显减少，即使球蛋白增加而保持血浆蛋白总含量基本不变，血浆胶体渗透压也将明显降低。慢性肝病时，肝脏合成白蛋白减少，血浆胶体渗透压也将降低，致血管通透性增加，血浆外渗。 2.2 一氧化氮。一氧化氮(NO)具有多种生物学作用，在生理条件下，内源性NO作为调节心血管系统、神经系统和免疫系统的递质，发挥其调节微血管通透性的作用。在病理条件下，血管活性递质可诱导表达产生大量NO，使NO可达到相当高的浓度，从而影响血管内皮细胞的屏障功能，使之通透性升高。 2.3血小板活化因子。血小板活化因子是一种与花生四烯酸代谢密切相关的高活性的磷脂类递质，主要由活化的内皮细胞、血小板和中性粒细胞等释放，作用于内皮细胞膜上的PAF受体，导致内皮细胞收缩或损伤，使通透性增加 。PAF可诱导中性粒细胞与内皮间相互作用，激活中性粒细胞和内皮细胞，促使白细胞黏附于微血管壁上导致内皮细胞受损，且具有剂量依赖性和可逆性的特点。 2.4血管通透因子。血管通透因子(VEGF)为分子量46KD的同源一聚体糖蛋白，是高度特异的内皮细胞丝裂原，有两种受体，即含激酶领域区受体和fms样酪氨酸激酶I。VEGF的特异性表现往：只有血管内皮细胞具有其受体，VEGF与受体结合后，具有促进血管内皮细胞增生和提高微血管对大分子物质通透性的作用。VEGF的作用依赖于NO的存在 。血中NO水平增高时，血管通透性增加。 2.5炎性递质。炎性递质是炎症过程中形成或释放的参与炎症反应的活性物质。在炎症和应激条件下，机体可产生许多炎症递质和细胞因子，如：组胺、血栓素、缓激肽、肿瘤坏死因子alpha; 、血管内皮生长因子、血小板活化因子等，这些因子均可引起血管内皮细胞连接损伤和功能障碍，从而导致血管通透性增强，形成组织水肿，但不改变微静脉的口径。 参考文献
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