开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
麦冬为百合科植物麦冬(Ophiopogonjaponicus(L.f.)Ker-Gawl)的干燥块根，气微香，味甘、苦，具有养阴生津、润肺清心等功效，对心血管系统疾病也有一定的治疗作用。此外，麦冬还可用于降血糖、镇咳。现代药理研究表明麦冬类药材具有显著的抗炎活性,鲁斯可皂苷元为其主要活性成分之一[1]。
鲁斯可皂苷元(Ruscogenin),又名假叶树苷元,最早是从生长在地中海地区的假叶树(RuscusaculeatusL.)中分离得到的一种甾体皂苷元,具有显著的抗炎、降低毛细血管通透性、调节前列腺功能失调、抑制G 菌和抗弹性蛋白酶等作用[2]。前期研究表明,麦冬水提物在体内外具有明显的抗炎活性,麦冬皂苷D及其苷元Ruscogenin为其主要活性成分,可明显抑制FMLP诱导PKC、PI-3K及MAPKs等信号通路引起的中性粒细胞（PMN)呼吸爆发的现象。
中性粒细胞（PMN)是人体抵御外来微生物入侵的第一道防线,是固有性免疫系统中重要的效应细胞。它可借助Fc受体及补体受体通过吞噬、脱颗粒、ADCC(抗体介导的细胞依赖的细胞毒作用)发挥其杀伤功能[3]。在激活状态下,中性粒细胞能产生大量的超氧阴离子，超氧阴离子进一步衍变为过氧化氢、羟自由基等氧自由基，即活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS),这些分子具有很高的反应性,可以与细菌的细胞膜、核酸分子及蛋白质发生氧化还原反应,造成微生物的损伤和死亡。此外,ROS还可上调一些细胞因子及粘附分子，如TNF-alpha;、IL-1、ICAM-1，这些趋化物质可与中性粒细胞膜上的相应受体结合,触发了包括p38MAPK、PI3K、ERK、JNK、蛋白激酶C等多途径信息系统，导致中性粒细胞自血管进入组织发挥非特异性免疫作用[4]。但激活失控的PMN大量释放的氧自由基和多种蛋白水解酶，是造成炎症损伤、系统性炎症反应综合症（SIRS)甚至多器官功能不全综合征（MODS)的重要原因同时释放促炎因子,放大炎症效应。
PMN呼吸爆发和脱颗粒的相关信号转导途径相当复杂,表现在:①多种胞外刺激信号均可引起PMN的呼吸爆发和脱颗粒反应；②引起PMN呼吸爆发和脱颗粒的多条信号转导途径间相互影响和调控,形成复杂的网络；③同一胞外刺激信号,可以通过不同的信号转导途径引起PMN呼吸爆发和脱颗粒;④呼吸爆发和脱颗粒虽然都是PMN的效应反应,但两者的信号转导途径又有一定区别,对不同的刺激物或调节物表现出不同的敏感性[5]。
丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-acitveatdPoretinklnase,MAPK)家族是一类存在于真核细胞中的丝/苏氨酸蛋白激酶,是介导细胞反应的重要信号系统，激活后使细胞核内相应的转录因子磷酸化,启动DNA，在细胞增殖、分化、运动、凋亡中起着关键作用。MAPK包括细胞外信号调节激酶(Exacrteulllar-signalregulatedproteinkinase,ERK),c-Jun氨基未端激酶(c-Junamino-terminalkinase,JNK)/应激激活蛋白激酶(Stress-acitivatedproteinkinase,SAPK)、p38等MPAK亚族,通过高度保守的三级激酶级联反应的方式传递信号:细胞外刺激使MKKK(MAPkinasekinasekinase)激活,转而激活MKK(MAPkinasekinase),然后通过对苏氨酸(Threonine,T)和酪氨酸(Tyorssine,Y)的磷酸化激活MAPKs[6]。MAPKs通过对生理性和/或病理性刺激作出的不同反应，来调控细胞的增殖、分化和凋亡等细胞生物学行为。同时，MAPKs的激活促进各种炎症介质的合成与释放。
ROS和氧化应激可介导MAPKs信号途径的改变,诱导细胞凋亡。ERK与生长因子受体后信号传导有关,而渗透压的改变和炎性细胞因子如TNF、IL-l等可导致JNK和p38的激活。其中JNK/SAPK和p38MAPK两条途径在氧化应激的研究中引起广泛关注:如乙醛可通过增高胞内ROS水平导致JNK蛋白磷酸化水平升高,激活JNK途径诱导心肌细胞凋亡;过氧化物H2O2可有效激活心肌细胞JNK和p38MAPK信号途径；而阻断或抑制JNK信号通路,可减少高氧暴露下肺细胞的凋亡；氧化应激可通过JNK磷酸化激活线粒体依赖性激酶Mc-l,诱导细胞凋亡[7]。
研究发现，鲁斯可皂苷元可通过抑制活化的ECV304细胞与HL-60细胞之间的粘附作用，发挥抗炎作用。而细胞内MAPKs信号通路介导了中性粒细胞的活化，在作为终末分化细胞的PMN内,MAPK激活主要与呼吸爆发有关,尤其是p38MAPK的激活。MAPK能识别并磷酸化NADPH氧化酶组分中p47phox分子的两个丝氨酸残基,导致呼吸爆发[5]。
因此，本课题欲以FMLP为刺激剂，采用蛋白质免疫印迹法（Westernblotting)，即将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法，检测NADPH氧化酶活化的关键亚基p47phox磷酸化蛋白和信号传导通路ERK1/2、p38、Akt磷酸化蛋白的表达。具体操作方法欲通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品，并转移到固相载体上，以目的蛋白作为抗原与对应抗体反应，再与标记好的二抗反应，最后以底物显色或放射自显影的方法检测目的蛋白的表达。
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