胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESC）具有无限自我增殖更新能力，更可以通过人工诱导分化成为特定类型的细胞[1]。由于其独特的生物学特性和功能，ESC被应用于生物医学的众多研究中，但也由于ESC来源导致的伦理问题，其临床应用受阻。近年来，对于干细胞的研究逐渐转向于诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）领域。2006年, Takahashi等[2]率先实现了体细胞重编程为iPSCs，实验小组成功将Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4四个转录因子导入小鼠皮肤成纤维细胞，迈出了体细胞重编程的第一步。接下来在2007年, iPSCs技术在人体细胞上取得成功, Takahashi等[3]和Yu等[4]先后将人成纤维细胞重编程为iPSCs，对于iPSCs的研究又更上了一个台阶。自Takahashi等[2]利用Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4四个转录因子实现重编程iPSCs之后，不同的研究小组又运用相似的方法和采用不同因子的组合证实了该方法的可行性，同时也发现，可被重编程的细胞不局限于特定的细胞类型及特定的分化阶段，其可以是内中外三胚层任一胚层来源的细胞，既可以来源于胚胎细胞也可以来源于新生儿、成人甚至是终末分化的成熟细胞[5-6]。
诱导自人体细胞的iPSCs可以被进一步诱导分化成所需的细胞类型用于临床治疗或在体外建立疾病模型，为新药开发提供理想的实验材料。研究者已成功进行iPSC细胞在体外定向诱导分化为不同体细胞，例如神经前体细胞、运动神经元、多巴胺能神经元、造血细胞、胰腺细胞和肝细胞、分泌胰岛素的beta;细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞、胰腺细胞和耳蜗毛细胞等[1]。由iPSC体外定向诱导分化出的细胞(包括前体细胞)在治疗相应疾病方面均展示出一定疗效。iPSC还为新药的开发提供了理想的模型: 药物的毒性和有效性甚至作用机理都可以在 iPSC或由iPSC产生的特定细胞中得到研究[7]，这对于广大研究者来说无疑是强有力的帮助，对于人类的健康以及再生医学领域来说更是巨大的福音。
本实验目标是将人源成纤维细胞转化为诱导多功能干细胞（iPSC）。成纤维细胞重编程为iPSC的几个关键步骤和环节如下：a．分离和培养人源成纤维细胞，直至达到下一步实验要求的条件；b．用病毒 (逆转录病毒、慢病毒或腺病毒)感染成纤维细胞；c．过夜后，除去病毒，将感染过的细胞用特定培养基进行培养；d. 将形态、生长状况良好的iPSC克隆单独培养，定期换液和传代。本实验具体的试剂使用、实验操作和进程安排参考Thermo Fisher Scientific的产品手册[8]。本实验过程除一般的体细胞重编程过程外，主要针对病毒的用量、细胞感染效率、培养基的选择等作进一步的研究。
由于人源皮肤成纤维细胞易于获取 ,又易于在体外生长 ,故目前皮肤成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到较广泛的运用 ,其分离培养技术已相对成熟 ,对其体外生长规律也有了较全面的认识[9]。
目前临床应用的主要是病毒转基因整合到宿主基因组中，常用的重编程病毒载体一般包括四种Yamanaka因子：Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4，利用这四种因子有效地重编程。研究发现c-Myc是一种在高表达时可能致癌基因，Klf4也与癌变有关，因此病毒重编程载体可能导致多次插入[10]和致瘤性风险[11]。尽管获得iPSC的过程在技术上已较以往相对成熟，但重编程始终是一个缓慢且低效的过程，并且已经开发了多种方法来解决这些问题[12]。然而，这些方法中的大多数具有一个或多个限制，例如低重编程效率或需要多轮转染或仅对特定细胞类型如皮肤成纤维细胞有效。因此在这里，我们拟采用仙台病毒来进行对于人成纤维细胞的病毒感染，此种方法可以达到无印记重编程（footprint-less reprogramming）。仙台病毒是属于副粘病毒科的负链RNA病毒[13-15]。与其他RNA病毒不同，它以负向单链RNA的形式在受感染细胞的细胞质中复制，不经过DNA阶段，也不整合到宿主基因组中[13]。利用仙台病毒进行重编程有以下优点[8]：a.重编程载体能够在增殖和静止状态下转导广泛的细胞类型；b.病毒与靶细胞的短接触时间足以建立转导；c.转基因的高水平表达；d.转基因的快速表达:在转导后6 - 10小时即可检测到表达，转导后24小时以上检测到最大表达；e.零足迹:载体和转基因可以从细胞中消除。有研究表明，仙台病毒与其他重编程方法相比还拥有更高的重编程效率和更低的感染复数（multiplicity of infection，MOI）[16]。因此，仙台病毒的性质使其成为细胞重编程和干细胞研究的理想工具。在这些条件下产生无转基因的iPSC对于促进基于iPSC的治疗和应用将是至关重要的。
在获得iPSC后需要进行对其的分析与检测。细胞的多能性要满足两个基本条件: 自我更新能力和分化潜能。目前有很多种具体的指标可用来评判获得的iPSC是否与ESC一样具有多能性, 如形态学标准、标志分子的表达、生长特性、发育潜能、表观遗传学特征等. 通过免疫荧光技术（Immunofluorescence）利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
流式细胞术（FCM）是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。对悬液中的单细胞或其他生物粒子，通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选。
三胚层分化基于iPSC在一定培养条件下在体外可分化成含三个胚层来源细胞的多细胞结构，即EB，在其内可检测到外胚层细胞如beta;-Ⅲ tubulin 阳性神经元、Tuj1阳性的神经元、Nestin 阳性细胞和星形胶质细胞，中胚层细胞如 CD34 阳性细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞和脂肪细胞，内胚层细胞如AFP (alpha-fetoprotein) 阳 性 细 胞 以 及TROMA-Ⅰ阳性的滋养外胚层细胞等[1,3]。
参考文献：
[1]申红芬, 姚志芳, 肖高芳, et al. 诱导性多潜能干细胞(iPS cells)——现状及前景展望[J]. 生物化学与生物物理进展, 2009, 36(8).
