开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 拟研究或解决的问题
1. 构建含有增强绿色荧光蛋白EGFP的慢病毒四质粒系统，利用脂质体转染293T细胞,包装完整慢病毒颗粒。
2. 病毒颗粒感染非分裂期细胞、难转染的细胞，并采用荧光显微镜、流式细胞仪等评价转染效率和病毒滴度。
二、采用的研究手段
1.基因克隆：将不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后转入宿主细胞中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。本实验中是将增强绿色荧光蛋白EGFP和PLV分别双酶切够后连接，经大肠杆菌转染、PCR验证之后与包装系统共转染293T细胞，从而高效包装病毒颗粒。
2.脂质体转染：阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用结合，从而将DNA分子包裹入内，形成DNA一脂复合体，该复合体被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，进入细胞。本实验通过四质粒共转染，与脂质体形成复合物而进入细胞，进而包装成完整病毒颗粒。
3.流式细胞仪：经特异荧光染色的细胞经激光照射激发发出荧光供收集检测，细胞成分中能够产生的自发荧光的分子的含量越高，自发荧光越强；培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；细胞样品中所含亮细胞的比例越高，自发荧光越强。本实验中产生的病毒颗粒转染T细胞等难转染的细胞后，转染成功的细胞含有EGFP，在激光照射下可通过产生的绿色荧光判断转染效率和病毒滴度。
4.荧光显微镜：以紫外线为光源， 用以照射被检物体， 使之发出荧光。本实验构建的慢病毒载体含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，它是由绿色荧光蛋白GFP人源化改造而来, 含有P64L和S65T突变和改造过的密码子, 拥有更强激发荧光强度, 更高的哺乳动物细胞内表达量和检测灵敏度。若转染成功，在荧光显微镜的照射下可显示绿色荧光。
- 文献综述
据报道，慢病毒已经发展到一定水平，现在基于HIV的慢病毒载体的临床研究已经应用于人体。国外已经进行了一系列的从基础到临床的系统研究工作, 包括构建有效载体所需的最少的HIV-1 基因、S IN 载体的构建、应用HIV-1 载体包装细胞系、非人类慢病毒载体的应用等;尤其是在安全性方面, 在用H1V-1 为载体的体内及体外实验中,迄今尚未发现诱发宿主免疫反应的产生, 表明其安全性是有保证，目前慢病毒载体已广泛应用于基因治疗、移植排斥反应治疗、神经系统疾病治疗、肿瘤基因治疗、转基因动物生产等方面。
慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体,属于慢病毒属，慢病毒属（lentivirus）在分类上属于逆转录病毒科，为二倍体RNA病毒[1]。原发感染的细胞以淋巴和巨噬细胞为主，导致感染个体发病。慢病毒感染的主要临床特点是在出现典型的临床症状以前，经历较长的潜伏期，之后缓慢发病，因此被称为慢病毒。慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag 、pol 和env3 个基本结构基因外, 还包含4 个辅助基因vif 、vpr 、nef 、vpu 和2 个调节基因tat 和rev。而慢病毒载体则是以慢病毒的基因组为基础，将其中多个和病毒活性相关的序列结构去除，使其具有生物学的安全性，然后，再在这个基因组骨架中引入实验所需要的目标基因的序列和表达结构，并将之制备成载体。当质粒DNA转染进入包装细胞，以及辅助质粒及载体质粒的RNA包装入同一病毒颗粒时，将有可能发生重组产生复制型病毒，减少这种可能性的方法之一就是将gag/pol和rev编码序列隔离，分散在不同的质粒上，这样的包装系统需要四质粒来代替原有的三质粒包装系统[10]，质粒一携带了gag/pol编码序列及RRE，质粒二包含了编码rev的序列，质粒三是载体序列，质粒四表达env,采用四质粒代替三质粒系统、除去tat[2]均减少了产生复制型病毒的可能性，从而增加了载体系统的安全性。
