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开题报告
一、研究目的
重组人促红素注射液（rh-EPO）处方中加入了大量人血清白蛋白(下述简称：HSA)作为保护剂，由于HSA的干扰，现有检测方法（SEC-HPLC法）无法适用纯度检测，因此开发新方法对rh-EPO注射液进行检测。
二、研究内容
- 实验仪器
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编号 |
仪器 |
公司名称 |
型号 |
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1 |
液相色谱系统 |
Waters |
Waters e2695 |
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2 |
紫外可见检测器 |
Waters |
Waters 2489 |
|
3 |
荧光检测器 |
Waters |
Waters 2475 |
|
4 |
超声清洗器 |
BOLONG |
USC-502 |
|
5 |
电子天平 |
METTLER |
PL402-L |
2.色谱柱
SEC-HPLC: TSKgel G3000SW色谱柱（5mu;m, 7.5 mm times;600 mm）；
RP-HPLC: GRACE VYDAC 218TP C18 色谱柱（5mu;m, 4.6mmtimes;250mm）。
3.实验试剂
EPO空白制剂；EPO成品（2000单位和1万单位）；EPO原液(内标物，批号：EYS140701，经SEC-HPLC检测纯度为100%，蛋白含量：2.37 mg/mL)；超纯水；乙腈；TFA；NaCl；KH2PO4；Na2HPO4；
4.实验方法
首先以EPO原液为研究对象，拟采用强制破坏手段，用SEC-HPLC法检测EPO原液的破坏情况，确定EPO中可能存在的主要杂质。
再使用文献中所介绍的RP-HPLC方法来分析EPO样品以及样品中的杂质，验证文献中提供的方法是否适用于本公司的产品，对方法进行优化。借助EPO原液确定聚体的检出限度，分析该方法对于EPO成品检测的适用性。
然后要对这个方法进行方法学验证，验证的方法主要根据中国药典来设定实验的条件，拟验证项目有：专属性、高低浓度准确性、重复性和中间精密度、对检测样品的线性和定量下限进行考察。此外还需进行系统适应性试验。
方法学验证后得出该方法是否合理可靠。最后，用这种方法完成对稳定性成品的检测。待检测的成品放置时间不等，由公司提供。
三、研究方法和手段
1.实验前：
文献研究法（查找检测EPO成品的方法）；
2.方法开发：
验证文献方法是否适用于本公司产品，对方法进行优化。
模拟法（用EPO原液来摸索EPO强制性破坏条件）；
- 方法学验证：
专属性验证（空白、样品和对照都在相同的条件下检测）
准确性试验（两组浓度计算回收率和RSD等）
重复性（进六针相同的样品）
精密度（要求不同人员不同日期的试验）
定量分析法（用峰面积、RSD等来表现方法的特性）；
线性范围（设定不同进样浓度，得出标准曲线）
- 系统适应性试验
将分析设备、电子仪器与实验操作、被测试样品等一起当作完整的系统进行评估试验。
5.稳定性成品检测：
定性研究法（检测有无聚体杂质等）；
四、主要成果形式
研究报告和论文。
五、主要参考文献：
1. Jadwiga Dudkiewicz Wilczy—Ska*, Iza Roman and Elobieta Anuszewska: The separation of EPO from other proteins in medical products formulated with different stabilizers. Polish Pharmaceutical Society［Ｊ］,2005, 62 (3):177-182.
2. Shaligram S.Rane, AlkeshAjameri, RustomMody and P.Padmaja: Development and validation of RP-HPLC and RP-UPLC methods for quantification of erythropoietin formulated with human serum albumin. Journal of Pharmaceutical Analysis ［Ｊ］,2012, 2 (2):160-165.
六、预计工作进度
预计三月完成分析方法开发，四月进行分析方法学验证，五月检测成品、数据汇总、撰写实验报告和毕业论文。
七、文献综述
1.摘要和关键词
本篇综述中,主要介绍了EPO药物的作用，本课题的研究所涉及到的一些基础知识和几种目前较为成熟的成品检测方法。
关键词：EPO；HSA；免疫亲和色谱；毛细管电泳；HPAEC；HPLC；
2.引言
EPO是促红细胞生成素（Erythropoietin）的英文简称。人体中的促红细胞生成素是由肾皮质肾小管周围间质细胞和肝脏分泌的一种激素样物质。机体缺氧是肾脏分泌EPO的基本动力，肾脏通过相应细胞（肾皮质细胞等）感受机体血氧浓度的变化，对EPO的产生进行调控，从而参与和促进红细胞的生成过程。
由于服用促红细胞生成素可以使患肾病贫血的病人增加血流比溶度（即增加血液中红细胞百分比），EPO已经成为治疗肾病贫血的主要药品之一。现如今，药品生产厂家通常应用生物技术制药的方法来生产EPO。
为了确保rhEPO药物成品的稳定性，很多的生产厂家将人血清白蛋白（HSA）用作药品的辅料。此外，HSA还可以避免蛋白对容器的一部分吸附作用。HSA的剂量通常为1-2 mg/mL，要比活性物质的剂量高出一百倍。HSA对检测EPO的方法有很大影响，这使分析检测遇到了一些困难。因此，设计一种可以检测EPO药物成品的方法较为迫切。
本课题涉及到生物化学、生物技术、分析化学、药物分析等领域。
3.主要内容
根据所查阅的的文献，目前EPO成品的检测主要有以下几种方法。
（1）亲和色谱法（IAC）
Pilar Lara-Quintanar等人的研究[1]表明，免疫亲和色谱法可以有效的从EPO成品中分离HSA。免疫亲和色谱法是指利用抗体或者与抗体相关的材料作为固定相的色谱，待测物与固定的抗体结合，其他样品基质由于不与固定相结合而被除去。其原理是抗体对抗原性物质的选择性结合。
将HSA分离后则可以用多种后续分析方法（空间排斥色谱法SEC-HPLC等）来分析EPO，HPLC在分析纯化的r-Hu EPO单体蛋白[4],[5],[6]方面比较成熟但这种需要分离后再分析的方法，使其不太适用于日常的药品质量控制中。
（2）毛细管电泳法（CE）
CE法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的。这种方法在近几年的生物分析领域中发展很快，它甚至已经有了描绘EPO糖型的功能。其中最为突出的毛细管区带电泳法，已经作为一种鉴定测试项目被录入欧洲药典（EP）的EPO专题中[2]。此外，也有一些其他的毛细管电泳法可以用于分析包含盐类与HAS的EPO的成品制剂（EPO的浓度范围是0.03-1.92mg/mL）。
（3）超高效液相色谱法（UPLC）
UPLC是一种在液相基础上减小固定相的粒度从而增加色谱柱效能的方法。RP-UPLC法搭配紫外检测器可以直接定量分析与其他蛋白（HSA，用做药物辅料）共同存在的EPO样品[7]。该分析方法快速，进样体积小，分离度、准确度和精密度都很高。但固定相粒度的减小需要更小的系统体积和高速的检测器，系统所能承受的压力也很高。因此UPLC成本也较高，目前不太适用于目前日常的质控领域。
以上这几种方法虽然都可以适用于EPO的检测，但若能简单的直接检测EPO成品，则会使日常的药品质量控制变得更加方便。根据文献提供的方法，RP-HPLC（反相高效色谱）可以有效的将EPO和人血白蛋白进行分离，同时也能分离EPO与EPO聚体。反相高效液相色谱中，流动相的极性大于固定相极性，分离前要对成品EPO注射液进行基本的处理，可能会得到一些EPO的聚体和HSA，这些分子通过这类反相层析柱，并按其极性大小进行移动从而实现分离。本课题应用该方法进行检测试验和分析验证。
4.综述参考文献
[1] P. Lara-Quintanar, I. Lacunza, J. Sanz, et al.,Immunochromatographic removal of albumin in erythropoietin biopharmaceutical formulations for its analysis by capillary electrophoresis,J. Chromatogr. A, 1153 (2007), pp. 227–234
[2] European Pharmacopoeia, Erythropoietin concentrated solution, (fifth ed.)Council of Europe, Strasbourg (2005) pp. 1528–1532
[3] D.M Luykx, P.J. Dingemanse, S.S. Goerdayal, et al., High-performance anion-exchange chromatography combined with intrinsic fluorescence detection to determine erythropoietin in pharmaceutical products, J. Chromatogr. A, 1078 (2005), pp. 113–119
[4] J.W. Dudkiewicz, A. Snycerski, J. Tautt, Acta Poloniae HPLC method for the determination of oxytocin in pharmaceutical dosage form and comparison with biological method, Pharm Drug Res., 59 (2002), pp. 83–86
[5] B.S. Kendrick, B.A. Kerwin, B.S. Chang, et al.,Online size-exclusion high-performance liquid chromatography light scattering and differential refractometry methods to determine degree of polymer conjugation to proteins and protein-protein or protein-ligand association States,Anal. Biochem., 299 (2001), pp. 136–146
[6] D. Gilg, B. Riedl, A. Zier, et al., Analytical methods for the characterization and quality control of pharmaceutical peptides and proteins, Pharm. Acta Helv., 71 (1996), pp. 383–394
[7] Shaligram S.Rane, AlkeshAjameri, RustomMody and P.Padmaja: Development and validation of RP-HPLC and RP-UPLC methods for quantification of erythropoietin formulated with human serum albumin. Journal of Pharmaceutical Analysis [J],2012;2(2):160–165
资料编号：[384936]
开题报告
一、研究目的
重组人促红素注射液（rh-EPO）处方中加入了大量人血清白蛋白(下述简称：HSA)作为保护剂，由于HSA的干扰，现有检测方法（SEC-HPLC法）无法适用纯度检测，因此开发新方法对rh-EPO注射液进行检测。
二、研究内容
