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开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字） 一、拟研究或解决的问题 1．Streptomyces griseusATCC13273中铁氧还蛋白还原酶的预测 2．铁氧还蛋白（Fdx）与铁氧还蛋白还原酶(Fdr)双表达载体的构建 3．CYP105D1与Fdx、Fdr的共表达及其对l-THP转化活性初步研究 二、采用的研究手段 1．利用BLAST序列比对从S.griseus ATCC13273全基因组中预测可能具有铁氧还蛋白还原酶的序列。 2．将铁氧还蛋白与铁氧还蛋白还原酶克隆至双表达质粒pACYCDuet-1的两个T7启动子之下，构建共表达Fdx、Fdr的融合质粒。 3．将融合质粒转化至E.coli BL21（DE3）中进行表达，并通过对诱导时间、诱导温度、IPTG浓度及加入时间、震荡转速等条件控制，优化其表达。进而将pET22b-CYP105D1与pACYCDuet-1-Fdx-Fdr共转化，初步研究工程菌株对l-THP的转化水平 三、文献综述 灰色链霉菌ATCC13273可以催化多种外源物质进行转化，例如芳香族化合物，脂肪族化合物以及环状化合物的羟基化反应、C-C键的裂解、环氧化、O-、S-、N-位的氧化、N-、O-位的去甲基化[1]。也可介导香豆素类、苯并吡喃类、鱼藤酮类以及生物碱类等多种天然化合物的生物转化。其相关的研究进展分别叙述如下： 大量研究表明，Streptomycesgriseus ATCC13273可以对青蒿素进行生物转化[2]，分别得到3位和9位羟基化产物以及9位酮基化青蒿素等一系列转化产物。此种菌株还可将萘羟基化从而生成1-萘醇，并可同时将2-甲基-1,4-萘醌转化为2-甲基-4-羟基-1-四氢萘酮[3]。据研究报道，streptomyces griseus ATCC 13273能将(Z)-2-benzylidene-1-azabicyclo[2.2.2]octan-3-one实行5位的羟基化反应[4]。还有研究报道显示streptomyces griseus ATCC13273可对左旋四氢巴马汀-异喹啉生物碱进行生物转化生成101位的去甲基化产物[34]。此外，有一研究报道显示此菌能将1,4-桉树油进行生物转化形成7位羟基化产物，并通过进一步的生物氧化反应得到7位酮基化产物[5]。Streptomycesgriseus ATCC13273可将妙林类抗生素生物转化，从而得到2位，7位以及8位的羟基化产物[37]。 研究报道Streptomycesgriseus ATCC13273还可对某一些底物进行甲基转移化反应，可将6,7-双羟基香豆素进行生物转化，生成7-羟基-6-甲氧基香豆素以及6-羟基-7-甲氧基香豆素[6]。灰色链霉菌的细胞提取物在乙酰辅酶A的催化下能够将4-氨基-5-羟基苯转化生成N-甲酰化衍生产物[7]这同时也揭示了存在于菌株中的N-乙酰基转移酶介导了这个反应。另有研究表示，S .griseus 能够催化alpha;-D-葡萄糖苷键、beta;-D-葡萄糖醛酸苷键以及L-鼠李糖苷键的裂解,裂[8], 在此过程中S.griseus催化beta;-D-葡萄糖苷键和alpha;-D-葡萄糖醛酸苷键的裂解, 说明此菌株在转化过程中产生了L-鼠李糖苷酶和beta;-D-葡萄糖苷酶。 细胞色素P450是存在于所有生物中的包含血红素的一组高级酶系，最初是在哺乳动物肝脏的微粒体中被发现[9]。细胞色素P450与类固醇类激素如孕酮的产生有关，P450功能非常强大，它们能催化许多复杂的反应，从甾醇的生物合成到芳香性石油化工产品的降解，还能催化NADPH/NADH-反应和一些需氧反应，还有有羟基化、乙基氧化、羰基氧化、环氧化作用、脱烷基化作用、杂原子氧化;稀释;环乳沟,扩张,耦合[10]。其中主要是混合功能氧化反应，广泛应用于立体定向化学。并且在药物代谢和异型生物质代谢中起着非常重要的作用[11]。在细菌中，P450s的存在则具有相当大的差异[12]，大肠杆菌基因组已被证实没有P450s而许多其他细菌则含有多个P450s同系物。链霉菌种属中含有丰富的细胞色素P450酶系，在链霉菌属中，它们主要用于次级代谢物生物合成途径及异型生物质分解代谢[13]。早期研究发现，豆粉可以诱导streptomyces griseusATCC13273中的细胞色素P450，科学家们对其中被诱导的P450-P450SOY进行了分离、纯化以及克隆表达，并命名为CYP105D1[14]。同时，研究还发现了CYP105D1能介导着多种外源物质的生物转化过程[15]。 个别的P450s，包括CYP105还能催化许多化学反应，一种酶就可以催化许多不同结构化合物的多种反应，例如，CYP105A1可以催化维生素D3连续进行两次羟基化并具有不同的专属性；CYP105D1已被证实可以催化氧化反应和脱烷基化反应，有一些酶催化底物的效率很低，使得科学家们产生了在相关底物中寻找工程新型化合物的兴趣。从链霉菌属griseus中分离的CYP105D1可以氧化包括樟脑、苯、芘、红霉素和华法林在内的许多异型生物质[16]。并且能催化 7-ethoxycoumarin的氧化脱烷基化[17]，但是，这些研究结果都是基于在使用不同表达的蛋白质基础上产生的，因此，P450在最初的链霉菌属细胞中的角色，所需的底物和催化功能仍然不能确定。 细胞色素P450由于能够在自然温和条件下催化多种加氧反应而这是化学方法难以实现的因而受到了广泛关注，这包括杂原子的去烷基化、非活性碳的羟基化反应，环化反应和C-C裂解反应等等。同时它的催化具有手性专一性和立体选择选择性的特点，在生物转化领域颇有开发应用前景[18]。 但是P450在现代应用过程中仍存在一些关键问题，使得其难于大规模的应用于工业生产领域，其中包括：许多P450酶难以在异源宿主中实现高活性的表达、酶对底物的低选择性以及电子传递蛋白的配对比较低效等。针对以上问题，目前针对P450的研究工作主要集中在以下几个方面：酶的定向进化、新的P450的发现和开发，筛选出最佳电子传递蛋白配对或者设计出含有电子传递链结构域的杂交P450，以及选择有效的辅酶再生系统或应用反光反应系统产生电子，从而提高和改善电子与还原力的原始性供给[19]。 1）电子传递蛋白的配对共表达 对于P450酶所介导的生物催化反应，不仅需要终端氧化酶P450，将电子传递给P450电子传递蛋白体系也是必不可少的过程。在真核生物中此过程通常是由细胞色素P450还原酶CPR介导完成，而在原核生物中则通常由铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶共同参与。但是，不同的电子传递蛋白的P450配对有较大催化效率差异，因而，找到最佳的电子传递蛋白配对，才能保证实现P450酶的高效催化。 近年来，随着大量生物的全基因组测序完成，利用基因挖掘技术， P450单加氧酶及其电子传递链体系中的氧化还原蛋白及氧化还原酶的生物学功能被相继鉴定，为高效电子传递链的体外构建奠定基础。电子传递链的体外构建指利用已报道的异源氧化还原蛋白的基因序列，通过分子克隆及重组表达技术，构建一个能够高效维持重组P450酶活性的体外人工体系[20]。目前，应用较为广泛的电子传递链包括ClassⅠ家族的菠菜铁氧还原蛋白/还原酶、假单孢氧还蛋白/还原酶、皮质铁氧还蛋白/还原酶， ClassⅡ家族的细胞色素b5，天然融合的电子传递链及在此结构基础上通过融合表达技术建立的人工融合电子传递链。 2)铁氧还原蛋白/还原酶 菠菜铁氧还原蛋白/还原酶是一个应用极其广泛的商业电子传递链。以辅酶NADPH作为起始电子供体，该电子传递链来自真核细胞，铁氧还原蛋白(ferredoxin, Fdx)是一种可溶的基质的蛋白质，而铁氧还原蛋白还原酶(ferredoxinreductase,FdR)则紧密结合在线粒体内膜上。不同于其他电子传递链，在添加菠菜铁氧还原蛋白/还原酶的过程中，Fdx与FdR的比例对催化效率有着至关重要的作用，过高会限制P450酶的羟化活性。在 P450SU-1催化VD3生产1alpha;, 25-(OH)VD3的反应过程中，Sawada等[21]发现，0.2 M FdR 与4 M Fdx的催化活性要远高于2 M FdR 与4 M Fdx。在异源性表达P450pyrTM单加氧酶的过程中，Pham等[22]以大肠杆菌作为宿主菌构建了双质粒表达体系，再利用其质粒拷贝能力的差异，尝试寻找出最佳Fdx于FdR的添加比例。在试验pACYCDuet、pETDuet、pCDFDuet、 pRSFDuet等一系列的双启动子质粒的前提基础上，构建了24株双质粒菌株并进行催化反应，得出P450pyrTm、Fdx 与FdR、的最佳表达比例是1∶100∶1.35，并通过外源表达葡萄糖脱氢酶(GDH)构建了NADPH的辅酶循环系统进一步将催化速率提高到了2.4倍. 3）杂交融合蛋白的设计与表达 将电子传递蛋白结构域与P450结构域融合成一条完整的多肽链，构建出杂交蛋白，是提高P450在催化过程中电子传递效率的另一种策略。目前，构建P450酶的人工融合蛋白的方法按电子传递链中蛋白质成份的不同可以分为两种：一是构建两个蛋白质的融合蛋白，例如，将ClassⅡ中的CPR或天然融合蛋白中的还原酶组分与P450酶通过Linker建立连接表达；二种是构建三重的融合蛋白(triple fusions)，将铁氧还原蛋白还原酶与两种不同种的铁氧还原蛋白或ClassⅠ中的配套的铁氧还原蛋白传递链通过两个linker和P450酶构建共表达 [23]。通过人工融合蛋白的方法，Luan等[24]成功将红球菌中的部分自给自足型P450SMO的自然融合蛋白还原酶和恶臭假单胞菌的P450cam通过人工linker(G4S)4在大肠杆菌中进行活性表达，但是在共表达了葡萄糖脱氢酶之后发现部分反应中NADPH的偶联效率比较低。通过计算机建模，Belsare等[25]分析了CinC与布氏柠檬酸杆菌的P450cin关键性组分CinA融合蛋白的构建过程，他们发现linker在长度为10个氨基酸残基的情况下共表达活力是最高的。将人体内VD3羟化酶与AdR和牛体的甾醇羟化酶电子传递链Adx通过三重融合蛋白的方法，Salamanca-Pinzn等[26]将pTC27A1作为表达载体，获得的重组菌能够羟化VD3与胆固醇，这使得传递中所有电子全部能用于细胞色素P450的催化。 许多相关研究对这方面也进行了很多尝试。例如，Zheng-Jiao Luan[27]等通过将P450与电子传递结构域融合，构建出新型的杂交酶，从而扩大了酶催化的底物范围，进而提高了酶的催化速率，细胞色素P450SMO是存在于红球菌ECU0066的是个天然的自给型细胞色素P450。它包含了黄素还原酶结构域、血红素结构域、一个[Fe2S2]铁氧还蛋白结构域、NADPH结合位点以及FMN结合位点。化学家们发现的第一个P450酶P450cam能够将樟脑催化生成5-羟基樟脑。其突变体P450cam (Y96F/V247L)则能够氧化单萜类化合物。在本研究中，人工构建了具备单萜氧化酶活性的P450杂交蛋白，即将P450cam的还原结构域通过一个(G4S)4和P450cam (Y96F/V247L)连接起来。杂交后酶可以催化alpha;-蒎烯(-)和-柠檬烯的羟基化，同时，-)-柠檬烯的转化也通过达NADPH再生系统葡萄糖脱氢酶（GDH）的共表达提高了。 在近期的相关研究中，科学家们尝试了更加复杂的蛋白杂交，并成功将在真核系统中膜定位表达了原核P450。 例如，基于阿维链霉菌MA4680中的CYP105D7能够将异黄酮转化生成邻位羟基化的产物，Chien-MinChiang等[28]构建了融合过的细胞色素P450，将CYP105D1的氮端与来自于米曲霉的CYP57B3的跨膜结构域融合同时，将其碳端则融合入酿酒酵母的P450还原酶，从而构建了一个兼具还原结构域以及膜锚定的融合蛋白。将其成功在毕赤酵母中表达，再利用重组毕赤酵母对染料木素和大豆苷元进行生物转化，分别得到了3＇-羟基化的染料木素（100mu;M 和6-羟基化大豆苷元。其在5L发酵罐中的产量分别达到了15mg/L 和7.5mg/L。 在自然界中，P450酶家族广泛存在于各种属来源的细胞中，具有着丰富的生物催化功效，相应的，其组成电子传递链的成分也多种多样。当前，由于P450酶的低活力、低稳定性、电子传递的较大依赖性，在生物转化过程中P450酶的应用非常有限。迄今为止，研究者尚未阐明P450酶催化体系中对不同电子传递链的选择机制及偏好选择。随着新型基因测序技术的日渐成熟，在挖掘及克隆表征P450基因的基础上，必将会发现更多的P450酶及其电子传递链中的氧化还原蛋白，在研究不同物种中丰富的P450酶的同时，也将会有更多的研究开始聚焦到电子传递链的研究。 P450酶电子传递链研究的兴起也必将为研究细胞色素P450酶这个重要的蛋白质家族提供新的视野与途径。
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