开题报告内容：
一、背景
缺血性脑血管疾病(ischemiccerebrovasculardisorders,ICD)是指某动脉供血区的血流短暂或永久的减少或中断而导致的中枢神经系统疾病,约占全部脑卒中的80%。对于缺血性脑血管疾病的治疗,目前仍以溶栓治疗为主,但应用中存在出血和再灌注损伤的危险和限制,而且,缺血脑组织发生再灌注十分常见。脑缺血-再灌注(cerebralischemia-reperfusion,CIR)损伤是指脑组织经历一定时间的缺血后恢复血流供应,使缺血性损伤进一步加重的现象。因此探讨缺血性脑损伤的机制,积极开发保护缺血性脑损伤的药物具有重大的理论意义和临床价值。
本课题采用H2O2损伤大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（phenchromocytomecell，PC12cell）来建立氧化应激损伤模型。体内H2O2主要来源于超氧阴离子的歧化反应,通过细胞膜与细胞内的铁反应生成OH-而产生细胞毒性[1]。H2O2与氧化应激反应密切相关,其主要产物OH-破坏细胞内氧化代谢的平衡,使抗氧化酶如SOD等活性下降,导致细胞内酶活力变化、代谢紊乱和DNA损伤,引起细胞凋亡。PC12细胞是来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的细胞系，在形态、生理、生化等方面接近神经元，同时具有神经内分泌细胞和神经元的特性，经常被用于神经细胞死亡方式和神经毒性损害的研究。本实验用H2O2损伤PC12细胞来模拟氧化应激损伤这一病理生理过程。此模型具有稳定可复制、损伤明显，可被药物对抗等特点。
二、指标检测
测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出量，测定丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性,噻唑兰(MTT)法检测细胞活力,免疫组织化学方法检测bcl-2的蛋白表达[2].
乳酸脱氢酶(LDH)是无氧酵解过程中的一个关键酶,在辅酶I的参与下催化乳酸和丙酮酸之间的相互转化。LDH广泛存在于动物各种组织细胞的胞浆中。病理情况时细胞膜通透性增高,导致LDH和胞浆中其他大分子物质漏到组织间液和血液中。检测LDH的漏出量可以反映细胞损伤的程度。
SOD是一种金属蛋白酶，带负电荷，也是体内非常重要的抗氧化酶和氧自由基清除剂，能清除超氧阴离子，保护细胞免受损伤，对机体的氧化与抗氧化平衡起重要作用。脑缺血时脂过氧化活跃，MDA生成增多，SOD则因消耗而减少，因而SOD活性可间接反映机体清除氧自由基的能力[3]。此外，自由基还可以直接增强Na-Ca2 逆向交换，进一步加重钙超载及损伤蛋白质和核酸，导致细胞坏死或凋亡。MDA是脂质过氧化反应的主要产物，中枢神经系统含有大量的不饱和脂肪酸，最易发生脂质过氧化反应，生成大量的过氧化脂质(LPO)。MDA是脂质过氧化反应的稳定代谢物，因而测定MDA含量可以反映组织中自由基的含量和自由基引发的脂质过氧化反应程度，间接反应细胞的损伤程度[4]。
MTT比色分析法是由Mosmann在1983年首创,其原理是活细胞内的线粒体脱氢酶可以将MTT(一种淡黄色的四甲基偶氮唑盐)还原成蓝紫色甲臜,而且形成的物质在560610nm下的光吸收值与细胞活性成正比关系[5],而多数报道表明甲臜在570nm下的光吸收值与细胞活性正比关系最佳,以此选取570nm测定吸光值[6-7]。此方法具有简单、快速、灵敏、稳定的特点,克服了常规方法的不足之处。
Bcl-2蛋白及其家族成员共同构成一个非常复杂的相互作用网络来调控细胞凋亡。线粒体通路的细胞凋亡由Bcl-2蛋白家族调节。Bcl-2蛋白家族分为2类:一类是抗凋亡蛋白，主要有Bcl-2,Bcl-w,Bcl-xL;另一类是促凋亡蛋白，主要有Bax,Bad,BakoBcl-2原癌基因是目前为止被认为最重要的凋亡抑制基因，分布在线粒体外膜、内质网和核膜，但只有分布在线粒体外膜的Bcl-2家族蛋白才能发挥调节凋亡的作用。Bc1-2家族对线粒体通路的调控主要通过线粒体通透性转换孔(PTP)实现，它的开放和线粒体内致凋亡的多种蛋白释放均受Bcl-2家族调控。Bcl-2和Bcl-xL或其他抗凋亡蛋白过表达使许多本可致PTP开放、细胞色素C及凋亡诱导因子(apoptosisinducingfactor,AIF)释放的刺激失效;而促凋亡蛋白Bax过表达导致线粒体跨膜电位丢失及细胞色素C释放。Bcl-2还可作为氧化剂调节细胞的氧化还原状态，从而通过抑制氧自由基的产生抑制凋亡，另外Bcl-2家族的抗凋亡作用可能还与内质网Ca2 流的释放有关，Ca2 流的释放也是凋亡过程中较早出现的变化，Bcl-2可以阻止内质网Ca2 流的释放，使胞浆中Ca2 水平维持稳定。Bax正常情况下以单体形式定位于胞质，受到凋亡刺激时构象发生变化，导致Bax寡聚体形成并整合到线粒体外膜导致CytC释放，从而触发凋亡。Bcl-2可与Bax形成异源二聚体，从而抑制Bax的促凋亡作用，因此Bcl-2/Bax比值高，细胞存活率高，比值低，细胞凋亡率高[8-9]。
