栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoidesEllis的干燥成熟果实，其性寒、味苦，归心肺三焦经，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒之功效。很多经典名方中都有栀子的配伍使用，如《伤寒论》中的茵陈蒿汤，《金匮要略》中的栀子大黄汤等，具有降压、镇静、止血、消肿等作用。现代研究表明，中药栀子具有显著的保肝利胆作用，栀子苷为其主要活性成分之一。
栀子苷（Geniposide）分子式为C17H24O10，分子量为388.37，别名京尼平苷，是一种环烯醚萜葡萄糖苷，易溶于水，主要存在于栀子、杜仲、肉苁蓉等植物，其中又以茜草科植物栀子含量最高，栀子苷是栀子的主要活性物质之一，对抗炎，降血糖，中枢神经系统，抗肿瘤等均有明显作用，能够减少肝脏自由基生成和增强自由基清除能力，抑制炎症因子释放，促进胆汁分泌和排泄，可预防肝细胞损伤，可降低肝微粒体中P4503A免疫相关蛋白密度，并具有一定的靶向性。有研究表明，栀子苷经大鼠十二指肠给药，可显著增加大鼠的胆汁流量，降低胆汁内胆固醇含量。此外，栀子苷对大鼠肌注黄曲霉素B1 ( AFB1，2mg/kg) 诱导的肝损伤具有一定的保护作用，可能是由于栀子苷增加GST活性对AFB1的解毒作用和介导gamma;-谷酰胺半胱氨酸合成酶对GSH的合成。
肝脏是身体内以代谢功能为主的一个器官，是胆汁形成、分泌及其再循环（肠肝循环）的重要场所。胆汁对机体内的内毒素、药物、某些代谢产物具有清除功能，胆汁中不存在消化酶，但是它参与食物的消化吸收过程，主要在肝脏中产生，肝细胞对胆汁的排泌过程是不间断的，大多数的胆汁主要储存在胆囊中，于机体进食时释放。胆汁淤积是由于许多原因导致胆汁生成或流动异常所产生的的一系列临床综合症，尽管现在对其的治疗有了很大的进步，但仍然缺少强效治疗药物，疗效有限，故寻找有效的治疗药物是提高治疗效果、改善生活质量的重要手段，具有重要意义。原发性肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全世界最常见的恶性肿瘤之一，死亡率很高。HepG2细胞具有典型肝癌细胞的一系列恶性特征，保留了一系列生物转化过程中的 I 相和 II 相酶，是研究和评价防治肝癌药物的较理想模型。所以我们选择肝癌细胞株hepG2细胞来研究栀子苷。
牛磺胆酸钠转运蛋白(sodium/taurocholate cotransporting polypeptide, Ntcp)是第10个溶质转运蛋白（SLC10）基因家族成员SLC10A1的编码产物。主要表达于肝细胞的基底膜与窦状隙，其表达受细胞因子、细胞内胆汁酸浓度、激素水平等因素的影响。在胆汁酸的肠肝循环中，胆汁酸需通过其重吸收进入肝脏,所以其与胆汁酸存在密切关系，NTCP可将经门静脉重吸收的胆汁酸盐摄取入肝细胞，当体内胆汁淤积时，高浓度的胆汁酸可反馈抑制NTCP的表达，NTCP的表达由于受到抑制又会使得胆汁淤积病情加重。
胆固醇7alpha;-羟化酶(cholesterol 7alpha;-hydroxylase,CYP7A1) 是胆汁酸合成经典途径的限速酶，催化胆固醇在肝脏分解为胆汁酸，属肝脏特异性微粒体细胞色素P450酶系。人体内近50％的胆固醇通过CYP7A1的催化转化为胆汁酸排除体外，因此CYP7A1基因作为胆固醇合成通路中最重要的调控基因，在维持胆固醇稳态及胆汁酸合成中发挥重要作用。CYP7A1基因定位于第8号染色体8q11-q12区域，其基因序列长度约11 kb，由5个外显子和6个内含子组成。其表达水平受基因多态性、胆汁酸水平、饮食、昼夜节律、激素、细胞因子、药物等因素影响。有研究表明，CYP7A1是受到FXR的调节来对胆汁酸的合成进行调节，FXR(nrlh4)是一种孤儿核受体，是核受体超家族lH亚家族中的成员，为配体依赖的转录因子，主要在肝、肾、肠、肾上腺表达。FXR是内源性胆汁酸的感应器，人体内的多种生理性胆酸都能将其激活，并促进其转录，其中尤以鹅脱氧胆酸作用最强。活化的FXR可启动一系列基因的转录活性，从而降低肝细胞内的胆汁酸浓度，而FXR最重要的生理功能是对胆酸生物合成的负反馈作用。在胆汁酸合成自身反馈调节途径中FXR对胆汁酸合成限速酶CYP7A1的调节是非直接的，因为CYP7A1的启动子不含FXR反应元件IR1。 FXR是间接通过诱导转录抑制因子SHP而发挥作用，SHP与CYP7A1启动子LRH-1结合并抑制LRH-1的转录激活功能，从而阻断CYP7A1的转录，使胆汁酸合成减少。所以，当体内胆汁淤积肝内胆汁酸水平升高时，可反馈抑制CYP7A1的表达。
结合目前的研究进展，为了进一步的考察栀子苷保肝利胆的作用，将以肝癌细胞HepG2为受体，给予适合的不同浓度的栀子苷后，同时设置GW4064处理组为阳性对照组，DMSO处理组为阴性对照组，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质免疫印迹法（Western blotting)技术对NTCP和CYP7A1这两个指标进行测定。通过两者的结果对比来探讨栀子苷的作用机制。
首先体外培养肝癌细胞株HepG2，培养完成并在用药物处理细胞后，进行上述两种方法的检测。RT-PCR是先提取总RNA，在对RNA的初步鉴定和定量后，进行RT-PCR反应，具体操作方法为先逆转录反应合成cDNA保存，然后利用PCR仪进行变性-退火延伸，经一定循环使其扩增，最后处理数据得出两种基因的RNA表达相对含量。Western blotting即用细胞核与细胞质蛋白抽提试剂提取蛋白后将蛋白质转移到PVDF膜上，然后利用抗体进行检测的方法。测定NTCP提取膜蛋白，测定CYP7A1提取总蛋白。具体操作方法为制备15%分离胶和5%积层胶，上样，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品，割取相对应分子量的目的蛋白条带转移到固相载体PVDF膜上，封闭后以目的蛋白作为抗原与对应抗体反应（4℃孵育过夜），再与辣根过氧化物酶标记好的二抗反应（室温孵育1h），最后以底物显色或放射自显影的方法检测两种目的蛋白的表达。
参考文献：
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