开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
研究背景和立题依据
假基因(pseudogene) 是指基因组中与正常基因序列相似，但是缺乏功能的 DNA序列。随着人类基因组计划的顺利实施，人们分离、鉴定新基因的速度越来越快，对于占人类基因组97％的非表达序列所谓垃圾DNA的研究 (只有约3％的人类基因组是由外显子序列组成的)，已成为全球范围内关注的热点。预计人类基因组中有大约20000种假基因［１］， 并且在线虫、果蝇、以及酵母等当中发现了大量假基因的存在［２、16］。根据是否保留相应功能基因的间隔序列（如内含子)，假基因分为两大类：一类保留了间隔序列，称为复制型假基因 (duplicated pseudogene)；另一类则缺少间隔序列，称为处理后假基因（processed pseudogene )。人类假基因中大约有一半多是处理后假基因。根据结构和起源假基因可分为加工假基因( processed pseudogene ) 和未加工假基因( nonprocessed pseudogene)。假基因通过复制和反转录转座两种方式不断地在人类基因组中出现。由于其大部分不能转录，没有生物学功能，不再像正常基因一样受到进化的选择，进化过程很难将其踢出，所以假基因在基因组中大量存在。假基因散布于有活性的功能基团之间，存在多种遗传缺陷，并且其作用有序列专一性，只影响与基因本身相似的一些序列。它与正常基因的不同在于以下几个方面，包括核苷酸缺失或插入；在基因内含子和外显子连接区发生序列变化；在编码序列当中含有终止密码子以及转录启动区出现缺陷。假基因的存在所造成的后果常使正常基因不能转录或翻译，或者产生有缺陷蛋白质从而失去原有的生物学功能［３］。
假基因由于不编码蛋白质，所以常被认为是无功能且不重要的，在很长一段时间都未被重视。近年来的研究已揭示由假基因所转录的RNA或者翻译的蛋白质具有多种功能。一些特征表明，假基因可能涉及人类癌症的发病机制［４、15］。假基因可能调控与它们同源的功能基因表达。有研究表明，细胞色素P450（CYP）4Z1，一个新的CYP4家族成员，在人乳腺癌中过度表达将促进肿瘤血管生成和乳腺癌的增长［５］，同时在乳腺癌组织中，假基因CYP4Z2P的表达量是远远低于其正基因CYP4Z1的表达量［６、14］。近期很多研究也发现，假基因对蛋白质的翻译还有调节作用，例如假基因的3UTR可以通过与正基因竞争microRNA反应原件（MRE）来调节正基因的表达，虽然这些假基因一般非常短小、难于识别，但是它们的功能非常重要，它们可以某些基因开启、关闭、更活跃或更不活跃［７、13］。
本课题主要研究假基因CYP4Z2P mRNA的3UTR与乳腺癌发生发展的关系，包括其与乳腺癌细胞增殖以及肿瘤血管生成的关系等。
肿瘤的生长、发展与转移需要血管生成,微血管的生成与肿瘤的生物学行为密不可分,抑制血管生成已成为近年来抗肿瘤研究的重要课题和热点问题。目前发现与肿瘤微血管生成有关的因子有20 多种［８］。本课题主要研究假基因CYP4Z2P mRNA的3UTR对于血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶（MMP）以及基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP）表达的影响。其中血管内皮生长因子(VEGF)是作用最强、特异性最高的一种血管形成因子,它的受体仅发现在内皮细胞上,可高效特异性地作用于血管内皮细胞,为内皮细胞的迁移及肿瘤细胞的转移提供基质,与肿瘤的发生发展关系密切［８］。肿瘤细胞发生转移必需降解细胞外基质, 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP) 是降解细胞外基质的重要酶类, 几乎能降解细胞外基质的所有成分。其中 MMP-9是研究较多的一种酶, 可分解健康组织的基质结构，使其松弛癌细胞转移增生, 组织的自我分解也能促使 MMP 的释放, 可通过水解生长因子, 黏附分子, 受体等触发一系列生物学效应,引起肿瘤细胞进一步的转移, 并调节肿瘤的生长分化、凋亡、以及肿瘤血管生成和免疫逃避。组织金属蛋白酶抑制剂 (tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP) , 是 MMP 的天然抑制物, 是一组能抑制 MMP活性的多功能因子, 与 MMP 的催化区以1: 1 可逆性结合, 抑制 MMP 的活性，其中 TIMP- 1 可与潜在的MMP-9 结合, 二者比例增高, 可引起瘤细胞的侵袭和转移［9-12］。
乳腺癌是临床常见的恶性肿瘤之一,严重威胁人类健康,探索乳腺癌治疗新技术、新方法具有重要临床意义。本课题拟对假基因CYP4Z2P mRNA的3UTR对VEGF、MMP以及TIMP的表达的影响，间接对其与乳腺癌发生发展的关系作出实验论证。本课题通过构建CYP4Z2PmRNA3UTR表达载体，以人类乳腺癌细胞株MCF-7 以及MDA-MB-231为目标进行体外培养实验，通过实时荧光定量PCR以及western blot等方法研究其对VEGF、MMP、TIMP RNA水平以及蛋白水平表达的影响，从而探索假基因CYP4Z2P对乳腺癌细胞发生发展的影响，从而让人们能更加深入的了解真核生物的基因调控网络，为肿瘤的治疗提供一种新的思路与方法。
具体实验内容：
1、构建表达质粒P2P-UTR。针对CYP4Z2PmRNA3UTR设计适宜的引物，选取合适的PCR条件，进行扩增，获取假基因CYP4Z2P mRNA的3UTR基因序列，并将其插入pSilencerTM4.1载体然后转化入大肠杆菌DH5alpha;感受态细胞中进行扩增，挑取单克隆，通过测序确认质粒P2P-UTR构建成功。
2、脂质体转染。利用脂质体Lipo-2000将表达质粒转染进入乳腺癌系细胞MCF-7和MDA-MB-231。
