开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
1.研究意义
由于P2X2/3受体广泛分布并参与如疼痛、味觉传导生理病理过程，针对P2X2/3异聚体进行功能性组成、受体配体的相互作用及其动态门控机制的研究具有很广泛的医学价值和潜在的应用价值，促进对离子通道天然存在形式的理解，并有效加快以其为靶点的药物设计和生物学功能研究。
2.研究目的
获得与内源性P2X2/3表达一致的串联体，为研究P2X2/3异聚体的通道功能提供稳定的体外表达体系。
3.研究现状
P2X受体是一类非选择性的阳离子通道，可在多种动物组织细胞中表达，可被胞外ATP激活，在胞外域有三个ATP结合位点[1]。P2X通道具有七个亚基（P2X1-7），可以组装成同源或异源三聚体。P2X2和P2X3亚基可以形成同源三聚体P2X2，P2X3或异源三聚体P2X2/3受体，每种受体具有独特的药理学性质,不同的受体亚型可能介导不同的病理性疾病。其中，P2X3同聚体和P2X2/3异聚体主要存在于外周初级感觉传入神经元和小直径无髓鞘C-纤维[2]，具有多种生理病理学意义。
P2X3受体已被证实参与多种疼痛的传导过程，如慢性神经性疼痛、家族性偏头痛、炎性疼痛以及癌症疼痛等[3]。P2X3受体可通过膜去极化和钙内流对疼痛纤维的直接敏化来促进疼痛传导，增加痛觉感受[2]，目前已有大量证据表明这种嘌呤能通路的失调与病理疼痛有关。Zhang等人最近的研究证明蛇毒素BomoTx可能是通过泛连接蛋白半通道的瞬时开放以诱导ATP从感觉神经元的释放，并且该ATP释放进一步激活相邻神经元上含P2X3的受体，该研究也表明由BomoTx触发的ATP释放刺激特定C-纤维，激活C-纤维上的P2X3受体，从而介导机械性疼痛敏化[4]。在家族性偏瘫偏头痛的遗传小鼠模型中，脑钠肽/利钠肽受体A（BNP/NPR-A）通路持续失活影响P2X3受体的磷酸化，增强了三叉神经节神经元中的P2X3受体电流[5]。参与伤害感受的另一种肽CGRP也被证明可调节P2X3受体在三叉神经损伤神经元中的膜定位, CGRP诱导P2X3受体的缓慢和持续上调，并导致偏头痛的疼痛致敏[6,7]。有文献报道P2X3受体在骨关节炎和类风湿性关节炎痛觉过敏的发展过程中起重要作用 [8]。在炎性疼痛模型中，胰蛋白酶和类胰蛋白酶通过切割其受体蛋白酶激活受体-2（PAR-2）使感觉神经元敏感，进而增加DRG中的P2X3通道活性[2,7]。参与炎症性疼痛的另一种主要信号分子PGE2也可以调节感觉神经元中的P2X3受体活性, PGE2治疗后观察到的DRG神经元兴奋性增加归因于P2X3通道的活性增加[2]。在关于P2X3受体在骨癌疼痛中参与增加的研究中也提出了P2X3受体的上调可以由肿瘤细胞释放的PGE2触发的机制[9]。在动物实验中，选择性P2X3、P2X2/3受体拮抗剂A-317491可暂时减轻小鼠癌症引起的骨痛[10,12]，用AF-353阻断P2X3和P2X2/3受体可以减少大鼠的骨癌疼痛[11,12]。此外，也有研究人员提出P2X3受体参与介导心绞痛，认为血管痉挛后反应性充血过程中内皮细胞释放的ATP通过微血管壁扩散，激活血管周围感觉神经上的P2X3受体，从而通过脊髓发送到疼痛信号到大脑的疼痛中心[8,13]。同时，有研究正在探索P2X3拮抗剂治疗抗绞痛和溃疡性结肠炎引起的疼痛的潜力[8,14]。
除参与多种疼痛信号的传导外，P2X3受体还参与多种病理状态的反射活动和信号传导过程。P2X3受体mRNA在高血压大鼠的化学感受性岩浅感觉神经元中表达上调[15]。这些神经元在高血压大鼠中产生强直驱动和反射亢进，而这两种现象可以通过阻断P2X3受体正常化。 P2X3受体的拮抗作用还降低了高血压清醒大鼠的动脉压和基础交感神经活动，并使颈动脉体反射亢进正常化[15]。用P2X3R拮抗剂处理啮齿动物减少了阿片样物质耐受性和对吗啡诱导的抗伤害感受的耐受性[16]。P2X3受体在癫痫大鼠和人群中表达上调，提示P2X3受体拮抗剂可能具有治疗癫痫效果[17]。在呼吸系统中，肺上皮细胞间隙内衬的神经内分泌细胞释放ATP响应肺扩张，然后刺激P2X3R激活源自结节神经节的迷走神经感觉纤维，该机制可以控制对有害气体和过度通气的反射应答[8]。P2X3受体在气道传入神经中表达并介导咳嗽反应的超敏反应，其拮抗剂AF-219正处于治疗慢性咳嗽的临床试验中。嘌呤能受体在鼻粘膜中表达，包括嗅觉神经元上的P2X3受体。在P2受体拮抗剂的存在下，气味敏感性增强，表明低水平的内源性ATP通常会降低气味反应性[8]。P2X3受体的激活反向调节气味反应，表明一种嗅觉感觉神经元的保护策略。P2X3受体同样也在味蕾细胞中表达[18]，但研究表明对于味觉传递发挥更大作用的可能是P2X2/3异聚体，我们将在下文进行讨论。此外，P2X3受体可在泌尿系统中膀胱、尿道、输尿管等传入神经纤维上表达，在病理条件下，例如神经源性膀胱，流出阻塞和间质性膀胱炎，嘌呤能受体分布可高达40％， P2X3R拮抗剂可用于治疗神经源性膀胱功能障碍[8]。
P2X2/3受体是第一个被功能和生物化学鉴定的P2XR异聚体，具有与P2X3受体相似的分布和药理学性质。可以拮抗P2X3受体的拮抗剂同样可以拮抗P2X2/3异聚体[2]，如上文提到的选择性P2X3、P2X2/3受体拮抗剂A-317491和AF-353在减轻动物骨癌疼痛的应用。值得注意的是，P2X2和P2X2/P2X3敲除小鼠的功能分析揭示，背根神经节（DRG）神经元中ATP诱导的电流由P2X3受体和P2X2/3受体介导，而在结节神经节神经元中受P2X2受体和P2X2/3受体控制[19]。在交感神经节神经元中，含P2X3的受体似乎不具有重要功能，而在膀胱中，P2X3受体和P2X2/3受体则共同调节膀胱反射[19]。上文简略提到在味觉传递中P2X3受体和P2X2/3异聚体起到关键作用。有趣的是，P2X2或P2X3的单个敲除仅具有较小的味觉表型，表明P2X2或P2X3能够在味觉传入中形成功能性同源受体[20]。P2X2和P2X3在大多数味觉神经节细胞中的共表达意味着神经纤维上的大多数P2X受体将是P2X2/P2X3异聚体，并且双敲除小鼠的研究表明P2X2/3异聚体受体可能是味觉信号转导的重要组成部分[18]。而前文提到的用于治疗慢性咳嗽的P2X3受体和P2X2/3受体拮抗剂AF-219在大剂量使用（每天两次600mg）下明显的副作用就是味觉紊乱[21]。这样的浓度不仅可以实现同源P2X3的完全占据，而且可以实现P2X2/3受体的完全占据[21]。值得庆幸的是，治疗咳嗽的效果可能更依赖于P2X3同源受体， 而AF-219对P2X3受体的效力远高于异源P2X2/3受体，因此较低剂量的AF-219可能保持功效，而对味觉引起的变化较少。
