人体时刻暴露在各种来自内源性代谢产物和外部环境的氧化亲电物质中。
这些反应性化学物质包括活性氧和活性氮，可以引发有害的氧化应激反应，但其浓度水平在细胞信号传导中也起着重要作用，因此需要一个微调的抗氧化调节网络来维持氧化还原稳态。核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）已成为监管网络中的关键节点。Nrf2介导一系列药物代谢酶，抗氧化蛋白和酶的细胞保护基因的转录，这些蛋白和酶可以中和和消除亲电和氧化攻击。Nrf2的活性降低已被认为是炎症性疾病的一种病理机制，增强Nrf2活性可能成为许多炎症性疾病的新疗法。
Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）是Nrf2的主要调节剂。在正常的生理条件下，Keap1在Cullin3（CuI3）的基于泛素E3连接酶复合物的装配中起到适配器组件的作用。在Keap1-Nrf2-Cul3复合物中，Keap1作为底物衔接蛋白，通过蛋白-蛋白相互作用（PPI）桥接Cul3和Nrf2，并且它也可以作为Nrf2泛素化降解的传感器和开关。该复合物组成性地靶向Nrf2泛素依赖性蛋白酶体降解，以调控Nrf2处于稳态水平。在氧化应激条件下，氧化和亲电试剂的增加会对Keap1中的半胱氨酸残基进行共价修饰，导致Keap1的构象变化。先前的研究表明，Keap1的构象变化可能破坏Keap1-Cul3和/或Keap1-Nrf2 的相互作用。 Keap1的共价修饰最终使E3连接酶失活并抑制Nrf2的泛素化。新合成的Nrf2可以摆脱Keap1，然后转位进入细胞核，激活下游细胞保护基因的转录。
在这个过程中，一个Nrf2蛋白通过高亲和力的“ETGE”基序和低亲和力的“DIDLG”基序与Keap1二聚体结合。传统上，“铰链锁钥”模式被广泛接受。高亲和力的ETGE基序充当铰链，将Nrf2与Keap1二聚体紧密连接，并且低亲和力DLG基序充当锁钥以开关以调控Nrf2泛素化。Keap1二聚体与两个基序的结合对于Nrf2的泛素化是必不可少的。进一步的研究表明Keap1-Nrf2复合物可以在正常生理条件下在以下两种不同构象状态之间相互转变：“开放”构象:Nrf2结合通过高亲和力的ETGE基序与单个分子结合，以及Nrf2中的两个基序与Keap1二聚体结合的“闭合”构象。Keap1-Nrf2复合物的构象在两种状态之间切换，并且只有闭合构象会导致Keap1依赖的Nrf2的泛素化，正如在“构象循环”模型中所概念化的一样。这些研究共同证实了Keap1-Nrf2 PPI在调节Nrf2激活中的重要作用。Nrf2-Keap1二聚体复合物的适当构象对于泛素化过程是必不可少的，并且破坏Nrf2 Keap1二聚体复合物的相互作用可以阻碍Nrf2泛素化，导致Nrf2的积累和活化。因此，探索Keap1-Nrf2 PPI抑制剂已经成为激活Nrf2的新方法。
Keap1-Nrf2 ETGE基序复合体的结构信息表明，由含ETGE基序（DEETGE）形成的二级结构对于Keap1结合是关键的。进一步研究发现，与6-mer序列相邻的疏水残基对于与Keap1的高结合亲和力非常重要，并且9-mer肽（Ac-LDEETGEFL-OH）可以保留大部分的高亲和力。这种“ETGE”基序为多肽Keap1-Nrf2抑制剂的开发提供了良好的起点。ETGE基序衍生肽的结构活性关系研究表明，ETGE基序中的两个Glu残基对于Keap1-Nrf2抑制活性是必需的，末端疏水残基可以增强效力。在多肽的进一步优化中，在用 Pro残基取代非必需的Glu残基后，减少了多肽的净电荷同时改善了活性。基于这些发现，我们设计了含有所有显示出高Keap1结合亲和力和Keap1-Nrf2抑制活性（肽1，Ac-LDPETGEFL-OH）的关键特征的肽。同时，也努力改善了多肽的细胞活性。用Nrf2-ETGE基序列结合细胞穿透反式激活转录激活因子（TAT）肽得到细胞活性多肽，它可以在完整的人THP-1单核细胞内以剂量依赖性方式上调Nrf2及其下游靶基因血红素加氧酶-1（HO-1）的表达。减少末端净电荷和添加大疏水基团也被证明有助于增强细胞活性。尽管已经通过多肽类化合物得到了具有令人鼓舞的Keap1-Nrf2抑制活性水平和Keap1结合亲和力的抑制剂，但它们不是细胞活性弱就是成药性差。因此，发现具有高细胞效力的多肽是进一步研究的主要目标。
环肽是经多种修饰的肽，是通过添加了一个额外的键形成了环状环结构。 该键可以是从N端到C端（头对尾）或其他化学稳定键如内酯，醚，硫醚，二硫化物等的酰胺键。 许多环肽已被用于临床，其中大多数来源于天然环肽。环肽与其线性对应物的主要优点是它们的构象刚性和蛋白酶抗性。环肽的刚性结构降低了吉布斯自由能的熵值，因此可以增强与靶蛋白选择性的结合。受限的构象对虚拟筛选也有益处，使计算问题（例如分子对接或构象搜索）更容易处理。 环肽的另一个突出特征是由于缺乏氨基和羧基末端而对蛋白酶水解产生抗性。 环化改变了肽在蛋白酶中对切割位点的可及性，并且环状肽甚至可以对内肽酶具有抗性。 另有充分的证据表明，与线性肽相比，环肽可能具有更好的膜通透性。另外，由于环肽模块化结构和易于制备的优点，肽和它们的线性对应物是用于药物-靶标验证的快速可用的前导结构，也可以是合成小分子的良好替代物。环肽的聚合性质也使每个残基容易被单独优化。其次，与合成小分子相比，环肽的全身毒性较小，并且它们不会在器官中累积。环肽的降解产物仅仅是没有毒性的氨基酸。第三，与小分子相比，环肽通常具有高选择性，因为它与靶标的相互作用非常特异。考虑到这些优势，能够展望将来会有更多的环肽将作为治疗剂和生物化学工具出现。
在这项研究中，我们将策略引入到肽抑制剂的开发中。 具有最少酸性残基的优势残基序列被用作环肽的模板，并且基于肽 - Keap1结合模式设计适当的缀合方法。得到的肽能与Keap1的Kelch结构域的紧密结合，在体外Keap1-Nrf2抑制和基于细胞的Nrf2激活测定中呈现出高效力，以及在小鼠RAW 264.7细胞中表现出有效抗炎作用。 这项研究证实了头尾成环策略在改善肽Keap1-Nrf2抑制剂的细胞效能方面的潜力，并提供了开发药物样肽作为治疗性Nrf2激活剂的可能性。
资料编号：[369457]
