开题报告内容：
一、研究目的与意义
传统抗体纯化工艺中常采用三步层析法，由亲和层析和两步离子交换层析组成，其中阳离子交换层析是抗体纯化工艺中的重要环节，采用结合-洗脱模式，主要去除样品中的碎片，多聚体，电荷异构体等痕量杂质，属于精细纯化，因此对阳离子介质的分辨率有着较高的要求。本次实验的目的是利用DoE平台优化阳离子介质的上样条件，优化载量，划定操作范围。大规模分离纯化考虑的因素与实验室水平分离纯化考虑的因素并不一致，通常要发展一种稳定牢固且廉价的纯化策略，尽可能的减少纯化操作并优化操作条件以提高过程的经济性。载量是大规模抗体纯化工艺中的重要参数，决定了纯化方法的可行性；层析柱的载量受多种因素影响，每种因素之间又存在着相互作用，因此有效地利用DoE平台对阳离子层析的上样条件进行优化具有重要意义。
二、研究方法
阳离子层析的载量受到层析介质，样品浓度，缓冲液pH、电导等因素影响，其中pH、电导的影响起到主要作用。因此本次实验采用高载量、高流速、高分辨率的Capto S ImpAct介质，针对溶液的pH和电导对上样条件进行优化。由于抗体是两性分子，溶液的pH会影响抗体分子在溶液中的带电情况，从而影响抗体与离子交换剂的结合能力，进而影响载量；而溶液的电导会影响抗体与离子交换剂的结合强度，同时也在一定程度上与溶液的pH相互影响。参考相关文献，将缓冲液pH和NaCl的浓度作为变量优化，样品使用经三步层析处理后的BKG原液，浓度稀释至5mg/ml，模拟上样前的样品浓度。如下表所示，设定溶液pH的变化范围为5.0~6.0，NaCl的浓度范围为0~50mM。
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High |
Low |
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pH |
6.0 |
5.0 |
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NaCl(mM) |
50 |
0 |
操作时，将层析柱接在柱位阀2，样品先走柱位阀1使管路中充满样品。待紫外吸收达到平台时，切换到柱位阀2，使样品通过色谱柱，此时抗体被吸附在色谱柱上，待样品10%穿透时停止上样，根据公式计算载量：DBC=，C=样品中抗体的浓度，=10%穿透时的体积，=系统的死体积，=色谱柱体积。
确定载量的DoE采用全因子实验模型包括图中四个角加中心3个点共7次试验。全因子实验可以得到变量对响应的主要影响因素以及变量间的交互作用，适用于层析条件的初步筛选。三、文献综述
随着生物技术的发展，治疗性单克隆抗体的市场逐年扩大，成为治疗肿瘤、自身免疫性疾病的有效药物。其中肿瘤是单抗应用最为广泛的领域，与传统的化疗药物相比，单抗的特异性更强且毒副作用更少，其独特的优势使得治疗性单抗的市场需求量迅速增长，Opdivo，Keytruda等重磅级PD-1抗体均为癌症治疗的革命性产品。随着抗体产量及规模的逐年增大，CDE对抗体类生物制品的质量要求越来越严格，抗体的质量控制应注意糖型和纯度等对抗体类药物的药效及免疫原性有重要影响的因素，选用的纯化方法和条件要在能去除杂质的情况下尽可能避免抗体的聚集与降解，连续生产的各批产品均能达到质检要求且批间具有一致性。
抗体的纯化工艺通常包括深层过滤，层析，病毒的灭活，超滤等环节，其中，层析是抗体纯化工艺中的重要一环，许多已上市的抗体药物均采用经典的三步层析法，即亲和层析加两步离子交换色谱，另外，亲和层析 阳离子色谱 疏水色谱及亲和层析 Capto Adhere两步层析技术，也在一定条件下得到应用。亲和层析 阳离子色谱 疏水色谱，这种模式通常用于高聚合度的抗体，其中疏水色谱的分离依据是溶质疏水性的不同；Capto Adhere是复合型强阴离子交换介质，在抗体纯化中采用穿透模式，减少了时间的消耗和缓冲液的使用，从而降低了成本，提高了经济效益。
经典三步层析法一般采用Protein A亲和色谱作为抗体纯化的捕获步骤，Protein A是从金黄色葡萄球菌中分离得到的一种细胞壁蛋白，能特异性地结和IgG的Fc段，抗体经过亲和层析处理后，被高度浓缩，大部分杂质被去除，此时抗体的纯度通常能达到98%以上。为了获得更高纯度的抗体，通常在亲和层析之后需要对抗体进行进一步纯化，由于抗体的等电点高于大部分宿主蛋白，这种特性为使用离子交换层析进行进一步纯化提供了便利。阴离子交换色谱普遍采用穿透模式，可以去除HCP、DNA、内毒素等杂质；而阳离子交换色谱采用吸附-洗脱模式，可以去除可能引起免疫原性的多聚体及影响药效的碎片与异构体等。
阳离子交换色谱能够去除产品中的痕量杂质，是产品质量把关的关键环节，因此对阳离子层析工艺的开发变得尤为细致。阳离子层析作为抗体纯化工艺的重要一环，在进行精细开发之前应确定其载量，在载量满足生产需求的区间内通过改变电导达到洗脱产物的纯度优化。因此对其上样条件进行优化，获得较大的载量成为本次研究的主要目的。实验中用到的Capto S ImpAct是一种强阳离子交换剂，由高交联琼脂糖基质与带负电的磺酸基和中性吡咯烷酮组成的多聚物配基结合而成，具有高流速，高载量，高分辨率等优点。实验采用了DoE (Design of Experiment)方法对阳离子层析的上样条件进行优化，标定满足目标载量的上样pH，电导范围。
DoE是在实验开始之前使用统计学对方案进行精确设计并利用结果进行处理的一种工艺开发策略，DoE首先要通过明确工艺目标，定义主要影响因子及其范围，分析这些因子对结果的影响方式（线性关系，非线性关系，交互作用），并将结果用数学模型表现出来使其可视化。传统的正交实验不能得到影响因子之间的相互作用，无法得到多因子下的最优值，甚至会得出错误的结论，而DoE软件可以通过模型进行预测，准确标定最优值出现的范围，从而对工艺参数的整体方向有一个较清晰的认识。DoE实验的主要类型有部分因子实验、全因子实验及“星点实验”。 部分因子实验用于筛选性设计和稳定性试验，适用于变量很多，需要对变量进行筛选的实验；全因子实验用于筛选性设计，适用于确定主要影响因子的实验，可以提供影响因子间的相互作用；“星点实验”用于优化性设计，目的是量化影响因子的“非线性”关系，可以提供曲率等相关信息。DoE设计是现代工艺的潮流和趋势，任何工业包括制糖，酿酒等生产工艺都需要DoE设计。抗体纯化工艺的优化通过DoE理念的渗透，能够在优化参数的同时，明确工艺的可控范围，这是对CDE近年来对生物制品工艺不断提出“稳定、可控”要求的一种实际行动。
参考文献：
[1]应国清,祝骥,易喻,梅建凤,陈建澍. 单克隆抗体纯化研究进展[J]. 中国医药工业杂志,2008,10:777-782.
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[7] Gagnon P. Technology trends in antibody purification[J]. Journal of Chromatography A, 2012, 1221(1221):57-70.
开题报告内容：
一、研究目的与意义
传统抗体纯化工艺中常采用三步层析法，由亲和层析和两步离子交换层析组成，其中阳离子交换层析是抗体纯化工艺中的重要环节，采用结合-洗脱模式，主要去除样品中的碎片，多聚体，电荷异构体等痕量杂质，属于精细纯化，因此对阳离子介质的分辨率有着较高的要求。本次实验的目的是利用DoE平台优化阳离子介质的上样条件，优化载量，划定操作范围。大规模分离纯化考虑的因素与实验室水平分离纯化考虑的因素并不一致，通常要发展一种稳定牢固且廉价的纯化策略，尽可能的减少纯化操作并优化操作条件以提高过程的经济性。载量是大规模抗体纯化工艺中的重要参数，决定了纯化方法的可行性；层析柱的载量受多种因素影响，每种因素之间又存在着相互作用，因此有效地利用DoE平台对阳离子层析的上样条件进行优化具有重要意义。
二、研究方法
阳离子层析的载量受到层析介质，样品浓度，缓冲液pH、电导等因素影响，其中pH、电导的影响起到主要作用。因此本次实验采用高载量、高流速、高分辨率的Capto S ImpAct介质，针对溶液的pH和电导对上样条件进行优化。由于抗体是两性分子，溶液的pH会影响抗体分子在溶液中的带电情况，从而影响抗体与离子交换剂的结合能力，进而影响载量；而溶液的电导会影响抗体与离子交换剂的结合强度，同时也在一定程度上与溶液的pH相互影响。参考相关文献，将缓冲液pH和NaCl的浓度作为变量优化，样品使用经三步层析处理后的BKG原液，浓度稀释至5mg/ml，模拟上样前的样品浓度。如下表所示，设定溶液pH的变化范围为5.0~6.0，NaCl的浓度范围为0~50mM。
