文献综述
研究的现状及发展趋势：
L一亮氨酸，又称 白氨酸，化学名为 a一氨基异己酸，1819年 Proust首先从奶酪 中分离得到，后来Braconnot从肌肉与羊毛的酸水解物中得到其结晶，并定名为亮氨酸。L一亮氨酸是常见 十八种氨基酸中的一种，也是人体八种必需氨基酸之一，另外由于 L一亮氨酸和 L一异亮氨酸 、L一缬氨酸 的分子结构中都含有一个甲基侧链而被称为支链氨基。L一亮氨酸为白色结晶或结晶粉末 ，是一种非极性氨基酸，味微苦 ，溶于水，20cc、25cc时溶解度分别为 23．7 L和 24．26 L，乙酸(10．9 g／L)、稀盐酸 、碱溶液及碳酸盐溶液 ，微溶 于醇 (0．72 g／L)，不溶于醚 ，加热到 145～148 ℃时升华 ，293～295 ℃时分解，比重 1．293(18 ℃)，比旋光度 [a] 为 l4．5 ～ 16．0(6mol／LHC1，C=1)，等电点 5．98【1】 。
氨基酸的制造是从 1820年水解 蛋 白质开始的。1908年 日本人 Ikeda发现谷氨酸钠是鲜味的强化剂，开始 了工业化生产氨基酸的历史。1957年 日本开始运用微生物进行谷氨酸发酵生产，从此揭开了微生物发酵方法生产氨基酸的历史新篇章。20世纪六十年代左右，关于 L一亮氨酸生物合成以及其代谢调节机制相继阐明。这为微生物发酵法生产 L一亮氨酸定向育种及酶法生产 L一亮氨酸提供了理论基础【1】 。
到目前为止，亮氨酸及异亮氨酸的提取方法主要有三种:一是乳状液膜法【2】;二是离子交换法【3.4.5】;三是加热除蛋白、等电点有机溶剂法【6】。在上述方法中，乳状液膜法研究了用乳状液膜法提取亮氨酸时,表面活性剂Span- 80用量、提取时间、石蜡用量、搅拌速率等因素对提取率的影响,在各项因素的最佳条件下进行提取,提取率为74.04 %。离子交换法利用离子交换法从L-异亮氨酸发酵液中分离提取L-异亮氨酸.考察了发酵液酸化pH值,不同浓度洗脱剂以及单柱与双柱串连吸附对L-异亮氨酸分离提取的影响.确定了发酵液酸化pH低于2.5,双柱串连吸咐,用0.2 mol·L- 1 NH4Cl-0.1 mol·L- 1 NH4OH复合洗脱剂洗脱的分离效果较好.提取总收率可达45 %以上。加热除蛋白、等电点有机溶剂法分别考察了蛋白去除温度及时间、活性炭用量、脱色时间、脱色温度、 发酵液 pH 值对 L-异亮氨酸分离提取效果的影响，在最佳工艺条件下，L-异亮氨酸提取收率为 94.3 % ，产品纯度高达 96.5 % 【3.4.5.6.】。加热除蛋白、等电点有机溶剂法最终收率远高于其他两种方法。通过蛋白去除温度及时间的确定、活性炭用量的确定、脱色温度的确定、脱色时间的确定、发酵液PH的确定，最终研究确定了提取的工艺条件，即蛋白去除温度及时间分别为 90 ℃和10 min、活性炭添加量为 2 %、脱色温度为 60 ℃、脱色时间为 25 min、脱色时的最佳 pH 为4.7。
目前也有三种方法精制亮氨酸及异亮氨酸【7.8】分别是浓度法、碳柱吸附法、超滤法。前两种方法中精制纯化率以浓度法为最高,碳柱吸附法次之,收得率均在60%一70%之间。超滤法因其能耗小、效率高,能在低温下操作,生物活性物质不易失活等特点,可除去发酵液中的病菌、病毒、热原等,近几年在分离浓缩精制生物活性物质方面得到了广泛的应用。超滤技术在氨基酸工业化存在的主要原因是膜污染和堵塞问题,料液中溶质等浓缩、结晶或沉淀,致使膜孔产生不同程度的堵塞。由于膜污染是亚微细粒子或小分子溶质吸附、积累在膜表面或在膜孔中结晶沉积所致,所以膜污染引起通量衰减往往是不可逆。浓差极化和膜污染都能引起膜性能的变化,使膜的使用性能变坏,而膜污染是膜通量和分离性能下降的主要原因。经过超滤精制后国产异亮氨酸粒度,透光度等质量指标基本达到日本样品的标准,大大缩短了国产异亮氨酸外观质量的差距。经过超滤精制后的异亮氨酸可以作为药用或食品出口到国际市场,给企业带来较强的竞争力和较好的经济效益。
随着后基因组计划的到来【9】蛋白质组研究成为生命科学的最前沿 。在用核磁共振(NMR)研究蛋白质结构以及定量蛋白质组学方面，C13标记的氨基酸和蛋白质都大有用武之地，已成为蛋白质组学领域不可 或缺的重要工具。C13标 记L一亮氨酸产品在医药工业、生命科学、食品工业 、分析测试等相关领域的广泛应用 ，特别是在医疗领域 ，其作用越来越突出。近年来，国内一些大医院也已开始利用C13标记L一亮氨酸对多种疾病进行诊断、治疗 。
张亮等【9】通过生物发酵法，自行研制L一亮氨酸一U一 C6。将黄色短杆菌TS151从斜面接 种于种子培养基中，每瓶接1环菌体，共接2瓶，置于摇床上 ，在 220 r／min下震荡培养2O h。在无菌条件下按1O接种量将新鲜种子液接入发酵培养基中(原料葡萄糖一 C丰度为 99 )， 500 mL三角瓶装液量50mL，置于巡回式摇床上 ，在 28 ℃ 、220 r／rain下培养 92 h，直到发酵结 束。发酵平均产酸16．6 g／L。将上述发酵液合并后用草酸调节pH至2～3，经离心分离(4800 r／rain，30 rain)，所得到的上清液用阳离子交换树脂(H 型 )吸附。先用蒸馏水洗至中性，然后用 0．2 mol／L氯化铵溶液进行洗脱，收集L一亮氨酸一U一 C单斑洗脱液；将上述洗脱液调pH至2．0后上阳离子交换树脂(H 型 )脱盐；收集L一亮氨 酸一U一”C单斑洗脱液，放入活性炭脱色、结晶。真空干燥得到L一亮氨酸一U一 C产品 ，产品丰度达97．O3，纯度98．5 %，提取收率 71．31 %。
林殿海等【10】L一异亮氨酸是人体必需氨基酸之一,目前巳新开发用以配制治疗肝炎、肝硬化病的支链氨基酸输液。国内70年代已选育到产L一异亮氨酸的抗代谢调节突变株。近来我们采用常规育种手段,选育一株多标记突变株,积累L一异亮氨酸量为15.l mg/。1并对其发酵产物进行分离提纯和鉴定。经多次诱变,获得产L异亮氨酸较多的突变株Am1423一56是一株多标记突变株,其产酸量达11.6 mg/ml。从选育谱系图看到,获得单一AHV抗性的突变株AT14,产酸量为3.7 mg/ml,经过再诱变,获得多重抗性的突变株AA142(AHVrsquo;、AECrsquo;、2一TA)t,产酸量有了明显的提高易达8.2 mg/mlo该突变株除AHV抗性外,又获得AECrsquo;,其天冬氨酸激酶不再受苏氨酸和赖氨酸协向反馈调节,从而增加了细胞内L一异亮氨酸合成的前提物一苏氨酸的量。另一方面L一异亮氨酸对苏氨酸脱氨酶的抑制作用减弱,再加上获2一TA抗性,使L一异亮氨酸合成的第二关键酶AHAS(乙酞怒基峻合成酶)不再受撷氨酸反馈抑制,因而产酸量得到大幅度提高。
在L-亮氨酸、L-异亮氨酸的合成中，应用氨基的叔丁氧羰基或三氟乙酸保护，开发了新的制备工艺【11】氨基苄氧基羰基及其在三氟乙酰保护剂应用中的应用，是在N-三氟乙酰基-L-亮氨酸反应中或在钯催化剂存在下，用氢进行基团处理而得到的。在本研究中，将三氟乙酰基-L-异亮氨酸与L-甲基酯结合，以开发制备这些化合物的方法。异亮氨酸或L-亮氨酸分别在存在用作氨基保护的二肽的情况下，以叔二环己基碳二亚胺为缩合剂，以叔氧羰基和较便宜的三氟乙酰基为缩合剂，得到了N-三氟乙酰基-L-的甲酯，在用亮氨酸-L-异亮氨酸和N-三氟乙酰基-L-处理时，它们很容易被去除。罗塞特基-L-等有效试剂亮氨酸-L-亮氨酸，用氢氧化钠与叔丁氧羰基-L-亮氨酸缩合，然后再与叔丁氧羰基或叔丁氧羰基反应，一步去除化合物中的保护基。L-异亮氨酸或L-亮氨酸与三氟乙酸酯反应混合物的酸化二环己基碳化二亚胺提供酸的作用导致目标二肽5-叔丁氧羰基-L-亮氨酸乙酯的形成。
