开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
栀子来源于茜草科（Rubiaceae）植物栀子（Gardenia jasminoides Ellis）的干燥成熟果实。栀子中含有40余种生理活性物质, 其中为国内外所公认的中药栀子有效成分为环烯醚萜类物质，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒的功效。栀子所含的环烯醚萜类物质包括栀子苷、京尼平苷、羟异栀子苷、栀子苷酸等,其中活性成分最高的是栀子苷和京尼平苷。
栀子苷是栀子的干燥成熟果实中含有的一种环烯醚萜苷类化合物，京尼平是其苷元。栀子苷分子式为C17 H24 O11，分子量为404.5，是栀子的主要药效成分，也是栀子药材质量评价的主要指标,具有抗炎、解热、利胆和轻泻等药理作用，临床应用广泛,可通过改变胆汁成分阻止胆固醇结石的形成。经前期研究发现，在诸多肝脏疾病研究的体内外模型中，栀子苷表现出了良好的肝脏保护作用。大鼠非酒精性肝纤维化模型中，给予其50 mg/kg剂量的栀子苷预先保护后，明显抑制肝纤维化，防止肝脏损伤。其中栀子苷通过抑制LPO诱导的损伤以及减少GSH的损耗，从而发挥治疗效果。在体外AML12 细胞模型的基础上，研究发现栀子苷抑制TGF-/Smad 蛋白和ERK-丝裂原活化蛋白激酶信号通路，发挥抗炎活性。
脑血宁注射液人体给药，根据尿中浓度数据和记录的尿液体积发现：给药后10 h内，人体内栀子苷大部分以原形由肾脏排出，约占总剂量的70%，给药后4 h内排除给药量的63%，该研究结果提示以原形从肾脏清除是静脉滴注后人体内栀子苷的主要排泄途径。大鼠尾静脉给予栀子苷的药代动力学研究也有少量报道。近年来，随着检测手段的提高，各种在体、离体技术的发展，栀子苷的药代动力学研究有了新的进展。对于栀子苷的药动学研究表明，从药物吸收来看，栀子苷给药途径的生物利用度的大小顺序为:尾静脉 ＞ 肌注 ＞ 滴鼻 ＞ 灌胃。大鼠进行尾静脉注射，得到栀子苷主要脏器分布规律为：肾＞肝＞心＞脾＞睾丸，但脑组织未见分布，其代谢成分也在探索阶段，不同的实验对象、不同的给药途径等均会影响栀子苷在体内的药动学行为。高效液相色谱法是对栀子苷准确、快速的定量测定方法,为其质量标准的制定提供了强有力实验依据。所以需要应用高效液相色谱法测定血浆中的栀子苷含量，在选定的色谱条件（流动相：甲醇-水（0.01%磷酸）（30:70）；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样量：30ul；检测波长：238nm）下，进样，记录色谱图并保存数据，然后进行离线数据分析，获取色谱保留时间、峰面积、峰宽等数据，计算出AUC、t1/2alpha;、t1/2beta; 、、Cmax 、Cl 、Tmax等相关的药动学参数进行分析研究。
本次实验采用的动物模型是alpha;-萘异硫氰酸酯( alpha-naphthyl-isothiocyanate，ANIT) 单次给药制作可逆性的急性肝内胆汁淤积模型。ANIT 作为一种间接肝毒剂，主要损害肝内胆管上皮细胞，引起肝内胆管增生及小叶间胆管周围炎症，从而造成胆管阻塞，形成明显的胆汁淤积，并伴有以点状坏死为主的肝实质细胞损害，产生胆汁淤积性黄疸，出现高胆红素血症和胆汁分泌降低。同时还引起膜脂质过氧化反应，致使肝细胞变性坏死，胞内ALT 大量溢入血流。该模型其重复性高，简单易行，成为经典的肝内胆汁淤积动物模型。本次实验所采用的实验动物为大鼠，分空白组和模型组。实验前大鼠禁食不禁水6 h，以保障药物的吸收。ANIT用油超声溶解，按大鼠体重5 ml /kg的剂量给药，造模48小时后给予栀子苷。大鼠尾静脉给药符合三室模型，且无明显蓄积现象。一般血药浓度一时间曲线的每个采样点不少于5个。分别于给药前（空白对照）及给药后5、10、20、30、40、50、60、90、120、180、240、360min眼眶取血0.3ml，血样采集到加有肝素抗凝剂的EP管中，血样于高速离心机中离心10min取上层血清（3500rpm）,-20℃保存备用。取制得的血清取上清90ul于1.5ml离心管中，加入内标溶液（原儿茶醛溶液（10ug/ml））10ul，涡旋混合15s,加400ul 1%甲酸乙腈涡旋3min后用离心机离心5min（3500 rpm），定量取上清液360ul转移至10ml 试管后挥干溶剂。残渣用100ul 0.1%甲酸20%甲醇水溶液溶解，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，取上清30ul于进样套管中进行高效液相色谱分析。对于处理好的血清样品，采用色谱一质谱联用法。随着检测技术的不断发展，多谱联用已经成为分析成分复杂样品的重要工具。色谱和质谱联用技术综合了色谱的高分离效能和质谱的高灵敏度等优点，可以有效克服常规检测方法所存在的缺陷。Xiaorong Ran等引以高效液相与质谱联用技术检测大鼠血浆中栀子苷和其他组分，稳定性好，分离度高。
同时，本实验还采取方法学研究。1.方法的专属性。在特定的谱条件下，将大鼠空白血浆、空白血浆加栀子苷对照品、空白血浆加绿原酸对照品和给药后血浆的色谱图进行比较。2.标准溶液的配制。栀子苷标准溶液的配制：临用前，精密量取一定量的储备液，稀释，用甲醇制成200，100，50，25，12.5，6.25，3.12，1.56，0.78ug/ml系列浓度梯度的标准溶液。原儿茶醛标准溶液的配制：临用前，精密移取适量绿原酸储备液，加甲醇制成每1ml含10ug的内标溶液。【5ml储备液 5ml 50%甲醇 50ug/ml标准溶液 取50ug/ml标准溶液 5ml 5ml 50%甲醇 25ug/ml标准溶液以此类推】3.标准曲线的建立。取空白血浆各90ul，分别加入第2项配置的栀子苷系列浓度对照品溶液10ul，使其质量浓度分别为0.078、0.156、0.31、0.62、1.25、2.5、5、10、20ug/ml，加入10ug/ml的原儿茶醛内标溶液10ul，涡旋15s混匀，再加入1%甲酸乙腈溶液400ul，涡旋3min混匀，12000rpm离心5min，定量取上清液350ul转移至10ml离心管中，挥干溶剂，残渣用100ul 0.1%甲酸20%甲醇水溶液溶解，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，取上清液30ul进样分析。以栀子苷与原儿茶醛峰面积比对应其浓度进行线性回归，得到栀子苷的回归方程。4.取回收率。按血浆样品标准曲线制备方法处理和检测高、中、低三个浓度（含栀子苷20、2.5、0.156ug/ml）的血浆样品，每个浓度测定6个样品。同时，另取相同浓度的药物标准品的纯溶剂溶液直接进样，获得相应峰面积。以两种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。将低、中、高三个浓度的样品所测得的峰面积比值代入标准曲线回归方程，得到的数值与血药实际浓度相比，得到方法回收率。5.精密度与准确度。按血浆样品标准曲线测定方法配制高、中、低三个浓度（含栀子苷20、2.5、0.156ug/m）的血浆样品，按上述血浆样品处理方法进行前处理，进行日间和日内精密度考察。日内精密度进行6个样本分析，日间精密度连续测定3天，并与标准曲线同时进行。用随行的标准曲线计算各批的血药浓度，测得浓度和实际浓度的比值即为方法的准确度。6.稳定性。按血浆样品标准曲线测定方法配制高、中、低三个浓度（含栀子苷20、2.5、0.156ug/m）的血浆样品各3份，-20℃放置7天后取出，室温下融化，按上述血浆样品处理方法进行前处理，测定栀子苷浓度，考察血浆样品的稳定性。取处理后的高、中、低三个浓度的栀子苷血浆样品各3份，室温避光放置8h后进样，测定栀子苷浓度，考察处理后血浆样品的稳定性。
目前，大鼠尾静脉给予栀子苷的药代动力学研究有少量报道，尾静脉给予栀子苷后在ANIT胆汁淤积大鼠体内的药代动力学与正常大鼠的区别尚未有研究。因此，本课题实验旨在通过HPLC测定大鼠血药浓度，探究比较得出尾静脉给予栀子苷在正常大鼠和ANIT诱导大鼠体内药代动力学的不同。
参考文献
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[ 2 ] Wang C J, Wang SW, L in JK. Suppressive effect of geniposide on the hepatotoxicity and hepatic DNA binding of aflatox in B1 in rats[ J] .Cancer Lett, 1991, 60( 2) : 95
