实验背景:
卷柏属(Selaginella)为蕨类植物门卷柏科(Selaginellaceae)植物,约700种,广泛分布于全世界。2015版《中国药典》收载卷柏药材来源于卷柏科植物卷柏Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring或垫状卷柏Selaginellapulvinatq(Hook,etGrev.)Maxim.的干燥全草。民间作为药用的有江南卷柏(Selaginellamoellendorffii),兖州卷柏(Selaginellainvolvens),深绿卷柏(Selaginelladoederleinii),薄叶卷柏(Selaginelladelicatula),中华卷柏(Selaginellasinensis),翠云草(Selaginellauncinata)等20多个品种[1]。它们性状较为相似,难以区分。传统医学认为卷柏性平味辛,归肝、心经,能破血散瘀,活血通经。现代药理及临床研究表明,卷柏具有抗炎、抗病毒、镇痛、降血压、降血糖、抗痛风和增强人体免疫功能等作用。
卷柏有特殊的进化意义,其最早出现于3.5亿年前的石炭纪时期,是水生植物向陆地植物进化的关键过渡生物,也在整个植物进化过程中扮演着十分重要的角色。而石松类植物是进化的维管植物的一个分支。石松类植物有无种子植物相似的特征,最显著的是孢子体世代和配子体世代都释放单倍体孢子,而不仅仅是依赖于孢子体释放单倍体孢子。同时它也有维管植物的典型特征,比如孢子体世代作为主导,并且很复杂,有木质化的维管组织。
据文献报道,卷柏属植物化学成分有所区别,药理作用及强度有所不同。为了鉴别卷柏属植物,科研人员做了巨大努力。曹园等对卷柏药材进行显微鉴别,并建立穗花杉双黄酮和selaginellin的HPLC含量测定方法[10]。刘义梅等确定了江南卷柏药材的性状和显微鉴别特征,建立了江南卷柏药材所含主要成分穗花杉双黄酮的TLC鉴别方法和HPLC含量测定方法[11]。丁奇等从性状鉴别,显微鉴别,薄层色谱鉴别方法研究石上柏,确定其茎横切面呈卵状梯形,薄层色谱上有两个荧光斑点的鉴定方法[12]。
采用这些传统鉴定方法鉴定中药材真伪较为简便,但是对鉴定人的技术水平要求较高,在物种鉴定上也有一定的局限性。为了保证中药材临床应用准确、安全、有效,在现有鉴定方法的基础上发展了中药材DNA条形码分子鉴定方法。如孙红梅等应用ISSR分子标记技术,研究34种卷柏科植物(其中18种药用植物)的亲缘关系,发现它们有较明显的分界[13]。WeiGu等人采用DNA条形码分子鉴定方法研究卷柏属植物的样本,发现ITS2序列能准确区分出卷柏属植物。
DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术。此方法流程主要有五大步骤,主要包括供试品处理和DNA提取、PCR扩增、测序、序列拼接,结果判定。DNA条形码研究第一步是确定所需DNA条形码序列。研究植物时,主要从叶绿体基因组和核基因组中寻找理想的DNA条形码,研究者曾提出诸多候选条形码序列和组合。2010年,陈士林等分析比较了7个候选DNA条形码(psbA-trnH,matK,rbcL,rpoC1,ycf5,ITS2,ITS),结果表明ITS2在物种水平的鉴定效率高达92.7%,表现突出。因此,陈士林等建议将ITS2作为药用植物标准DNA条形码。
因此,中药材DNA条形码分子鉴定是以ITS2为主体条形码序列鉴定中药材的方法体系,其中植物类中药材选用ITS2为主体序列,psbA-trnH为辅助序列;动物类中药材用COI为主体序列,ITS2为辅助序列。文献表明,DNA条形码分子鉴定方法已应用于药用植物和中药材,也建立了中药材DNA条形码鉴定体系和数据库,涵盖多国药典中绝大部分药材的DNA条形码序列,以此来实现对中药材基原物种、粉末以及细胞、组织等材料来源的准确快速鉴定,可以满足不同行业不同科研背景工作者对中药材鉴定的要求。
但关于多组分的中药制品,以及生药饮片的鉴定研究的相关报道较少。而中药材品种混乱,为中药材流通领域、中药生产企业的原料监管、医院饮片的真伪鉴定、海关中药材进出口鉴定与管理、出入境检验检疫等方面带来较多问题。因此利用中药材DNA条形码分子鉴定法鉴定物种和规范市场已十分迫切。
卷柏作为一种蕨类植物,除了药用价值,还有较大的观赏价值。如美化,绿化,彩化,净化等功能。其主要用于园林绿化,盆栽,盆景山石配置,盆景造型,切花配叶等。开展卷柏属植物资源的研究,对于丰富园林配植素材,提高园林景观的观赏价值,扩展园林绿化的层次和空间,增加城市园林和城市林业的景观多样性和生物多样性,创造可观的经济效益和生态效益具有十分重要的意义
