开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一．课题简介
口腔鳞癌是头颈癌的一种，目前其治疗还以手术、化疗、放疗等为主，但随着近年来靶向治疗的发展，靶向药物在口腔鳞癌治疗中的作用越来越重要，目前口腔鳞癌的靶向治疗药物主要围绕表皮生长因子受体（epidermalgrowth factor receptor, EGFR）、血管内皮生长因子受体（vascularendothelial growth factor re-ceptor, VEGFR）两方面设计。西妥昔单抗是一种根据EGFR设计的高活性单克隆抗体，在提高口腔鳞癌疗效的同时不存在治疗相关毒性，且能延长患者生存期。但是临床一些口腔鳞癌患者对西妥昔单抗产生获得性耐药现象，使得该类药物的使用受到了一定限制。本课题旨在初步探究如何建立及鉴定对西妥昔耐药的口腔鳞癌细胞模型，帮助后续进一步探究口腔鳞癌细胞对西妥昔单抗的耐药机理。
二．实验方法
1.肿瘤细胞体外培养：包括细胞复苏、细胞换液、细胞传代、细胞计数和冻存等。
2.体外模型建立及鉴定：
2.1．克隆形成实验: 克隆形成试验可反映细胞群体依赖性和增殖能力。一般细胞在体外增殖六代以上，其后代形成的细胞群体称为细胞集落或克隆。每个克隆由单一细胞而来，含有50个以上细胞，大小在0.3-1mm之间。通过克隆形成可检测各种理化因素对细胞克隆形成能力的影响。平板克隆形成试验可检测贴壁细胞细胞的克隆形成能力，软琼脂集落形成试验可检测非锚着依赖生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系等。
2.2．流式细胞仪检测细胞凋亡实验（Annexin V 法）：AnnexinV是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA碎片检测比较，使用Annexin V可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V /核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V /核酸染料 )。
2.3．流式细胞仪检测细胞周期实验：通过核酸染料PI标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M/%，由此可以了解细胞的增殖能力，在抗肿瘤研究中，S期细胞比率通常作为判断肿瘤增殖状态的指标。
2.4.MTT法检测细胞增殖实验: MTT化学名为 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐,常用来测定细胞增殖及活性，检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在570nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。
