开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一、课题解决的问题

本课题通过建立DSS诱导的小鼠UC模型，基于AhR途径，揭示生物碱A发挥抗UC作用的机制，明确其可能的靶蛋白。为生物碱A作为UC治疗药物的开发提供药理学依据。

小鼠UC模型的建立，影响因素很多，应熟练掌握建模方法，进而更好地进行后续研究工作；熟练掌握Q-PCR和western blotting等实验方法。

二、研究方法和技术路线

研究方法

1） 采用3.5%的DSS复制小鼠UC模型，每日给予生物碱A（40 mg/kg）、5-ASA（200 mg/kg）和CH223191（10 mg/kg），持续10天；

2） 建模后，每日记录小鼠的体重、大便性状和隐血情况，并计算疾病活动指数；

3） 10天后处死小鼠，取结肠，固定远心端结肠组织，常规脱水，石蜡包埋，苏木精-伊红染色，封闭固定。对肠壁炎症、病变程度和隐窝损害3项指标进行评分；

4） 试剂盒法测定小鼠结肠中MPO活力；

5） ELISA法测定小鼠结肠中TNF-alpha;和IL-1beta;的水平。

技术路线

三、研究计划

2017年2月27日---3月15日 确定选题，查阅文献，撰写开题报告；

2017年3月16日---4月25日 建立DSS诱导的小鼠UC模型，观察其病理特征；

2017年4月26日---5月10日 采用试剂盒法测定小鼠结肠中MPO活力；

2017年5月11日---5月20日 采用ELISA法测定小鼠结肠中TNF-alpha;和IL-1beta;的水平；

2017年5月21日---6月8日 撰写论文、完成答辩。

四、文献综述

溃疡性结肠炎发病机制研究进展

摘要：

溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis, UC）是一种慢性且反复发作的主要病变部位在乙状结肠的炎症性肠道疾病（Inflammatory bowel disease, IBD）。虽然UC发病机制目前尚未完全明了，但近年来，随着基因组学、免疫遗传及分子生物学等发展以及DNA重组动物模型技术的日趋成熟，对UC的发病机制研究更为深入，大量的证据表明UC是环境、遗传和黏膜免疫三方面因素共同作用的结果，本文就针对这三个方面在UC发病中的作用做一综述。

关键词：溃疡性结肠炎；发病机制；环境因素；遗传因素；黏膜免疫因素

正文：

溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis, UC）是一种慢性的，反复的始于结肠并通常就近连续扩展至部分或整段结肠的炎症性疾病。临床主要表现为腹痛、腹泻、粘液脓血便、里急后重等，部分患者有肠外表现：如关节炎、肝胆管炎、眼葡萄膜炎及皮炎等^{[1, 2]}。UC的发病机制尚未完全阐明，但已被证实与环境、遗传和黏膜免疫等因素相关。目前对UC病因和发病机制的认识可概括为：环境因素作用于遗传易感者，在肠道菌群的参与下，启动肠道黏膜免疫系统，最终导致免疫反应和炎症过程。

1.环境因素

近年来，临床流行病学资料显示UC的发病率逐年增加，尤其是发展中国家，比如拉丁美洲，亚洲和东欧。这可能与当地人们饮食结构的改变有关，大量摄入肉类，蛋奶制品或者是摄入较少的膳食纤维，使UC患病率显著增高。这些食物中的胆固醇、糖、动物脂肪含量较高，可大在增加UC的发病风险^[3]。此外，心理神经免疫学研究表明行为因素和情绪能对全身和局部的炎症反应和免疫系统产生影响。临床上确实可以观察到一些UC患者在精神应激状态后发病或复发，并且有研究表明，UC患者显示出更高的抑郁指数其疾病状态也会加重，这些证据为预防UC提供了新思路^{[4, 5]}。最后，环境卫生和生活习惯也与UC发病密切相关，现比较明确的是阑尾切除和吸烟对UC的影响，有数据表明，在20岁前切除阑尾的人患UC的概率至少降低70%；不吸烟者的患病率是吸烟者患病率的三倍^{[6, 7]}，并且临床研究发现，吸烟能改善疾病的进程，至于吸烟对UC负影响的确切机制尚在研究中。

2.遗传因素

通过对双生子UC发病的研究，发现同卵双生子的患病率明显高于异卵双生子，证实UC发病具有遗传性。在上个世纪八十年代就有人观察到了UC的发病存在种族和地区的差异并且具有家族聚集性。种族的发病率研究结果显示，欧美白种人发病率较高，而亚洲黄种人与非洲黑种人相对较低。此外，地区的发病率研究结果显示，世界范围内，UC发病率以北美与西欧等发展国家发病率较高，而发展中国家相对较低^[8]。最后，流行病学研究结果显示，UC患者家庭中亲属发病率明显高于普通人群，经系统的家系调查统计显示，5%-20%的患者有家族遗传史。

3.黏膜免疫因素

3.1肠上皮细胞

随着分子生物学的发展，目前发现肠上皮细胞具有丰富的生物学功能，是肠黏膜屏障功能的主体。肠黏膜屏障由机械、化学、免疫、生物屏障组成，其中机械屏障主要由肠上皮细胞及紧密连接构成；化学屏障主要由肠黏液、消化液等构成；免疫屏障主要由巨噬细胞、树突状细胞及肠黏膜淋巴组织构成；生物屏障主要由正常肠道菌群构成，能有效阻止肠道内细菌及毒素易位。其中机械屏障是肠黏膜屏障最重要的组成部分，该屏障具有对肠内物质选择性通透作用，对水、电解质、葡萄糖和氨基酸等营养物质具有良好的通透性，而大分子物质如肠内抗原物质、细菌及内毒素可以起阻挡作用，选择性通透作用是由细胞间紧密连接所调节的，肠上皮细胞间紧密连接在维持机械屏障功能的完整、黏膜的稳定等方面起重要作用。

研究提示UC患者肠黏膜通透性显著高于正常对照者，并与疾病活动指数（Disease activity index, DAI）呈正相关，而且与疾病复发和预后有密切关系。在动物实验中，UC小鼠结肠黏膜通透性明显增加，伴随紧密连接蛋白如ZO-1和Occludin等表达的下调^[9]。此外，也有文献表明UC患者及硫酸葡聚糖钠（Dextran sulfate sodium, DSS）诱导的小鼠UC模型中，肠黏膜上皮细胞的生存时间明显缩短，上皮细胞凋亡率明显升高^[10]。

3.2树突状细胞（Dendritic cells, DC）

DC起源于骨髓造血干细胞，是目前发现的功能最强的专职抗原提呈细胞（Antigen presenting cell, APC）。DC既具有抗原提呈功能，又能激活CD8 及CD4 T淋巴细胞，既能启动免疫应答，又能诱导免疫耐受，是连接特异性和非特异性免疫应答的中间桥梁^[11]。DC前体细胞由骨髓进入外周血，在多种细胞因子的作用下分化为成熟DC和非成熟DC，非成熟DC主要存在于多种实体器官及非淋巴组织的上皮，表达较低水平的主要组织相容性复合物（Major histocompatibility complex, MHC）类分子，其提呈抗原的能力较强，而刺激初始T细胞的能力较弱。另一方面，成熟期DC主要分布于淋巴结、脾脏和派尔集合淋巴结内，在趋化因子的作用下，经血液和淋巴迁移至T细胞区，并逐渐成熟。此过程中，其表达高水平的MHC-Ⅱ类分子、CD80、CD86和CD40分子，提呈抗原的能力下降，而诱导免疫耐受的能力增强。

通过比较正常对照组、活动性和非活动性UC患者的DC类型及数量，发现非活动性UC患者血浆DC和骨髓DC数量与正常组比较差别无统计学意义，而活动性UC患者的血浆中非成熟DC数量明显下降，并且与肠道炎症程度明显相关^[12]。另一方面，成熟DC和T细胞的相互作用也参与UC的发病过程，成熟DC可以显著促进Treg细胞的分化，而Treg细胞在UC的发生发展中起着重要作用，提示DC在UC发病机制中发挥重要作用^[13]。

3.3巨噬细胞

巨噬细胞是组织常驻的主要单核吞噬细胞，在识别和消除细胞以及固有免疫和适应性免疫应答中发挥关键的作用。疾病的不同时期，组织内在环境的改变及产生细胞因子的变化将会诱导产生不同类型的巨噬细胞来分别介导促炎性反应或抑炎性反应。根据其细胞因子分泌及表面分子表达的不同，巨噬细胞被分为经典激活的巨噬细胞（M1）或非经典激活的巨噬细胞（M2）^[14]。IFN-gamma;及革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）活化的经典巨噬细胞即为M1型巨噬细胞，主要分泌大量的TNF-alpha;、IL-1beta;、IL-6、IL-12和IL-23，但IL-10的分泌量极低，起着介导急性炎症的作用。而通过Th2细胞相关因子如IL-4、IL-13及免疫复合物活化的为非经典巨噬细胞即M2型巨噬细胞，主要分泌IL-10，起着抑制炎症及组织修复的作用^[15]。

目前研究较多的为M1型巨噬细胞，经典激活的巨噬细胞可合成及分泌多种生物活性物质，如IL-1beta;、IL-6和TNF-alpha;等，这些炎症介质在UC的发病过程中起着重要的作用。在UC患者及UC小鼠模型中，结肠黏膜中IL-1beta;的表达显著上调，而给予IL-1受体拮抗剂可以明显减轻肠道炎症程度^[16]；IL-6可以通过活化STAT3信号通路从而加重小鼠UC，反之，给予IL-6单抗可以显著缓解小鼠UC ^[17]；在UC患者及UC小鼠模型中，结肠黏膜中TNF-alpha;的表达显著上调，正常动物给予TNF-alpha;后可以导致显著的肠道炎症性改变，UC患者及UC小鼠模型在给予TNF-alpha;单抗（如英夫利昔单抗、阿达木单抗等）治疗后其疾病症状可得到显著缓解^[18]。因此，巨噬细胞主要是通过相关炎性细胞因子的介导而参与UC的发病。

3.4 T细胞

UC患者肠黏膜淋巴细胞的异常激活，导致对肠黏膜组织异常免疫应答，胃肠道T淋巴细胞分布于肠道上皮层和肠道黏膜固有层等，其中固有层为黏膜免疫应答的主要效应场所，根据其在发育过程中细胞表面分化的抗原不同，较早将其分为CD4 T细胞和CD8 T细胞亚群，CD4 T细胞是机体适应性免疫应答的主要参与者，CD4 T细胞按照分化及功能特征又可主要分为效应性T细胞（Effect T cell，包括Th1、Th2、Th17）和调节性T细胞（Regulatory T cell, Treg）。各亚群间的免疫平衡紊乱与UC的发生发展密切相关。

Th1、Th2和Th17细胞

Mosmann等于1986年首次提出经典的Th1/Th2模式，该模式认为，CD4 T细胞可以分化为Th1和Th2细胞两个亚群，其中Th1细胞转录因子为T-bet，主要分泌IFN-gamma;等细胞因子，介导细胞免疫，具有抗细胞内细菌、病毒感染等作用；Th2细胞转录因子为GATA3，主要分泌IL-4等细胞因子，介导体液免疫和变态反应^[19]。Th1细胞和Th2细胞通过其所产生的细胞因子相互作用，维持细胞免疫和体液免疫之间的平衡。

有研究显示，UC倾向于Th2型细胞炎性因子上调为主，也有资料报道，UC是Th1和Th2共同作用的结果，在早期可能是以Th1细胞反应增强为主，而晚期以Th2反应占优势。无论基于哪种观点，Th1、Th2细胞及其维系调控的细胞因子表达失衡在UC的发病中都发挥重要作用^[20]。Zhao HW等报道DSS诱导的UC小鼠结肠中IFN-gamma;的水平显著上调^[21]。Wang Y等报道IL-21/IL-21R信号可以通过抑制Th1细胞的活化激活Th2细胞反应而抑制DSS诱导的小鼠结肠炎^[22]。

Th17细胞是近几年发现的主要以分泌IL-17A为主的一类CD4 T细胞，研究发现，其还可分泌IL-17F、IL-6、IL-21、IL-22以及TNF-alpha;等细胞因子，在自身免疫性或感染性疾病中发挥促炎作性作用。甲酸相关孤儿受体gamma;t（RORgamma;t）是Th17细胞分化过程中至关重要的转录因子，促进RORgamma;t的表达可以诱导Th17细胞分化，从而导致IL-17分泌增加。体外实验发现，TGF-beta;和IL-6共同作用可以诱导Th17细胞的分化^[23]。目前研究表明，UC患者及DSS诱导的UC小鼠模型外周血中Th17细胞数目明显升高^[24]，将来源于RORgamma;t^-/-小鼠的CD4 CD25^- T细胞转移到RAG-1^-/-小鼠，后者没有发生结肠炎，而转移CD4 IL-17A T细胞则发生结肠炎^[25]。Jin S等报道，低剂量的青霉素可以显著改善DSS诱导的UC小鼠疾病症状，其机制为低剂量的青霉素可以显著抑制肠组织中IL-17的表达水平，并且减少小肠黏膜固有层的Th17细胞数目^[26]。

Treg细胞

Treg细胞是不同于效应T细胞的具有调节功能的T细胞群体，主要分为两类：第一类是在胸腺中发育成熟的自然调节性T淋巴细胞（Natual regulatory T cell, nTreg）。第二类是由nave CD4 T细胞受刺激转化生成的适应性或诱导性T淋巴细胞（Adaptive or induced regulatory T cell, aTreg or iTreg）^[27]。叉头转录因子（Forkhead transcription factor p 3, Foxp3）属于foxhead家族分叉头/翼状螺族转录调节因子，是Treg细胞的特异性标志，持续表达Foxp3是维持Treg细胞抑制活性的必要条件。Treg细胞因具有免疫抑制功能而受到广泛的关注，其主要通过两种不同的方式发挥免疫抑制的作用：细胞接触抑制，通过表达对抑制免疫活化有重要作用的细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4）来竞争T细胞上的共刺激配体，从而能够抑制CD4 T细胞和CD8 T细胞的活化和增殖；独立机制，通过分泌抑制性细胞因子IL-10或TGF-beta;参与自身免疫耐受过程^{[28, 29]}。

研究发现，UC患者外周血中CD4 CD25 Foxp3 Treg细胞数目明显低于正常对照组并且其维持外周免疫抑制的功能明显被抑制^[30]；拮抗Treg细胞分泌的细胞因子IL-10可导致小鼠自发产生胃肠道炎症^[31]；给T细胞缺陷的小鼠体内注入nave CD4 T细胞，可导致其对肠道共生菌群的高反应性，引起严重的自身免疫性UC，而输入Treg细胞则可缓解UC，说明Treg细胞在UC的发生发展中起着关键性的作用^[32]。此外，在肠道局部免疫状态稳定时，Treg细胞与IL-23、IL-22等共同维持肠上皮黏膜屏障的完整。当Treg细胞数目减少或功能缺陷时，肠黏膜局部就会产生持续的炎症反应，导致损伤发生^[33]。

3.5 自然杀伤T细胞（Nature killer T cell, NKT）

自然杀伤T（NKT）细胞是一种同时具备自然杀伤细胞（NK）和T细胞双重功能的特殊免疫细胞亚群，其表面标志包括了CD16、CD3以及CD56，其表型为CD16 CD3 CD56 。这些细胞具有先天性和适应性免疫细胞的功能性质，并且能够在激活后快速分泌如IL-4、IL-12、IL13以及IFN-gamma;等细胞因子。NKT细胞被分成两个子集：I型或不变NKT（iNKT）细胞和II型或非变化NKT细胞。iNKT细胞由它们识别鞘糖脂alpha;-半乳糖基神经酰胺（alpha;-GalCer）的能力及其正常T细胞受体TCR-alpha;链的表达而定义，而非变体NKT细胞不识别该糖鞘脂并表达多样化TCR-alpha;链的阵列，NKT细胞可以在自身免疫性疾病例如炎症性肠病中发挥重要作用^[34]。

恶唑酮诱导的结肠炎被认为是Th2型结肠炎，与人类UC相似。在恶唑酮诱导的结肠炎动物模型中，炎症初期产生大量IL-4和IL-5，炎症后期主要以产生IL-13为主。进一步研究发现此恶唑酮诱导的结肠炎模型中，IL-13主要由NKT细胞而非CD4 T细胞产生^[35]。进一步研究发现，UC患者相比正常人分泌更多的IL-13，且这些IL-13主要来自NKT细胞而不是普遍认为的CD4 T细胞^[36]。进一步研究发现，NKT细胞对肠上皮细胞具有毒性作用，它可使肠上皮细胞溶解脱失，从而加重UC ^[37]。

综上所述，UC的发病机制是复杂的，是多环节、多因素综合作用的结果。我们应该更深入地研究并了解它们之间的关系，从而找到从根本治愈UC的方法。

参考文献：

[1] Park SH, Kim YM, Yang SK, et al. Clinical features and natural history of ulcerative colitis in Korea. Inflamm Bowel Dis 2007, 13 (3): 278-283.

[2] Hou JK, Feagins LA, Waljee AK. Characteristics and Behavior of Elderly-onset Inflammatory Bowel Disease: A Multi-center US Study. Inflamm Bowel Dis 2016, 22 (9): 2200-2205.

[3] 何新颖，唐志鹏．饮食与溃疡性结肠炎[J]. 世界华人消化杂志，2007, 15 (36): 3826-3829.

[4] Grundy D, Al-Chaer ED, Aziz Q, et al. Fundamentals of neurogastroenterology: basic science. Gastroenterology 2006, 130 (5): 1391-1411.

[5] Glavin GB, Murison R, Overmier JB, et al. The neurobiology of stress ulcers. Brain Res Brain Res Rev 1991, 16 (3): 301-303.

[6] Birrenbach T, Bcker U. Inflammatory bowel disease and smoking: a review of epidemiology, pathophysiology, and therapeutic implications. Inflamm Bowel Dis 2004, 10 (6): 848-859.

[7] Cosnes J Tobacco. IBD: relevance in the understanding of disease mechanisms and clinical practice. Best Pract Res Clin Gastroenterol 2004, 18 (3): 481-496.

[8] Vegh Z, Kurti Z, Lakatos P. The epidemiology of inflammatory bowel diseases from West to East. J Dig Dis 2017, doi: 10. 1111/1751-2980. 12449.

[9] Zou Y, Lin J, Li W et al. Huangqin-tang ameliorates dextran sodium sulphate-induced colitis by regulating intestinal epithelial cell homeostasis, inflammation and immune response. Sci Rep 2016, 6: 39299.

[10] Verstege MI, te Velde AA, Hommes DW. Apoptosis as a therapeutic paradigm in inflammatory bowel diseases. Acta Gastroenterol Belg 2006, 69 (4): 406-412.

[11] Rossi M, Young JW. Human dendritic cells: potent antigen-presenting cells at the crossroads of innate and adaptive immunity. J Immunol 2005, 175 (3): 1373-1381.

[12] Baumgart DC, Metzke D, Guckelberger O, et al. Aberrant plasmacytoid dendritic cell distribution and function in patients with Crohns disease and ulcerative colitis. Clin Exp Immunol 2011, 166 (1): 46-54.

[13] Zhao L, Shao Q, Zhang Y, et al. Human monocytes undergo functional re-programming during differentiation to dendritic cell mediated by human extravillous trophoblasts. Sci Rep 2016, 6: 20409.

[14] Martinez FO, Gordon S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep 2014, 6: 13.

[15] Tan Z, Xie N, Cui H, et al. Pyruvate dehydrogenase kinase 1 participates in macrophage polarization via regulating glucose metabolism. J Immunol 2015, 194 (12): 6082-6089.

[16] Shouval DS, Biswas A, Kang YH, et al. Interleukin 1beta; Mediates Intestinal Inflammation in Mice and Patients With Interleukin 10 Receptor Deficiency. Gastroenterology 2016, 151 (6): 1100-1104.

[17] Bank S, Andersen PS, Burisch J, et al. Genetically determined high activity of IL-12 and IL-18 in ulcerative colitis and TLR5 in Crohns disease were associated with non-response to anti-TNF therapy. Pharmacogenomics J 2017, doi: 10. 1038/tpj. 2016. 84.

[18] Qin Z, Wan JJ, Sun Y, et al. Nicotine protects against DSS colitis through regulating microRNA-124 and STAT3. J Mol Med (Berl) 2017, 95 (2): 221-233.

[19] Mosmann TR, Cherwinski H, Bond MW, et al. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. 1986. J Immunol 2005, 175 (1): 5-14.

[20] Li 1, Ueno A, Fort Gasia M, et al. Profiles of Lamina Propria T Helper Cell Subsets Discriminate Between Ulcerative Colitis and Crohns Disease. Inflamm Bowel Dis 2016, 22 (8): 1779-1792.

[21] Zhao HW, Yue YH, Han H, et al. Effect of toll-like receptor 3 agonist poly I: C on intestinal mucosa and epithelial barrier function in mouse models of acute colitis. World J Gastroenterol 2017, 23 (6): 999-1009.

[22] Wang Y, Jiang X, Zhu J, et al. IL-21/IL-21R signaling suppresses intestinal inflammation induced by DSS through regulation of Th responses in lamina propria in mice. Sci Rep 2016, 6: 31881.

[23] Marshall EA, Ng KW, Kung SH, et al. Emerging roles of T helper 17 and regulatory T cells in lung cancer progression and metastasis. Mol Cancer 2016, 15 (1): 67.

[24] Dong Z, Du L, Xu X. et al. Aberrant expression of circulating Th17, Th1 and Tc1 cells in patients with active and inactive ulcerative colitis. Int J Mol Med 2013, 31 (4): 989-997.

[25] Leppkes M, Becker C, Ivanov I, et al. RORgamma-expressing Th17 cells induce murine chronic intestinal inflammation via redundant effects of IL-17A and IL-17F. Gastroenterology 2009, 136 (1): 257-267.

[26] Jin S, Zhao D, Cai C, et al. Low-dose penicillin exposure in early life decreases Th17 and the susceptibility to DSS colitis in mice through gut microbiota modification. Sci Rep 2017, 7: 43662.

[27] Mayne CG, Williams CB. Induced and natural regulatory T cells in the development of inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis 2013, 19 (8): 1772-1788.

[28] Yamada A, Arakaki R, Saito M, et al. Role of regulatory T cell in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol 2016, 22 (7): 2195-2205.

[29] Wan YY, Flavell RA. TGF-beta and regulatory T cell in immunity and autoimmunity. J Clin Immunol 2008, 28 (6): 647-659.

[30] Gong Y, Lin Y, Zhao N, et al. The Th17/Treg Immune Imbalance in Ulcerative Colitis Disease in a Chinese Han Population. Mediators Inflamm 2016, 2016: 7089137.

[31] Xiong J, Lin YH, Bi LH, et al. Effects of interleukin-4 or interleukin-10 gene therapy on trinitrobenzenesulfonic acid-induced murine colitis. BMC Gastroenterol 2013, 13: 165.

[32] Haribhai D, Lin W, Edwards B, et al. A central role for induced regulatory T cells in tolerance induction in experimental colitis. J Immunol 2009, 182: 3461-3468.

[33] Himmel ME, Hardenberg G, Piccirillo CA, et al. The role of T-regulatory cells and Toll-like receptors in the pathogenesis of human inflammatory bowel disease. Immunology 2008, 125 (2): 145-153.

[34] Olszak T, An D, Zeissig S, et al. Microbial exposure during early life has persistent effects on natural killer T cell function. Science. 2012, 336 (6080): 489-493.

[35] Onitake T, Ueno Y, Tanaka S, et al. Pulverized konjac glucomannan ameliorates oxazolone-induced colitis in mice. Eur J Nutr 2015, 54 (6): 959-969.

[36] Biancheri P, Di Sabatino A, Ammoscato F, et al. Absence of a role for interleukin-13 in inflammatory bowel disease. Eur J Immunol 2014, 44 (2): 370-385.

[37] Wynn TA, Chawla A, Pollard JW. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature 2013, 496 (7446): 445-455.