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开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字） 一、拟研究的问题 本课题目的在于优化水蛭素-露那辛融合蛋白的表达和制备工艺。露那辛多肽在植物体内含量非常低，提取或合成成本很高，水蛭素分子已经在大肠杆菌中获得高水平分泌表达,本实验室在水蛭素的表达、分离、纯化和鉴定方面技术成熟。通过基因工程的方法将水蛭素与露那新通过连接肽拼接成融合蛋白，使其高效表达，再通过酶切释放出N-末端与天然露那辛完全一致且具有生物活性的目的多肽露那辛。通过对融合蛋白的表达及制备工艺的摸索，能够得到步骤简单，产物纯度及回收率较高的实验方案。 二、采用的手段 本课题主要分为两部分：第一部分是对已成功构建的重组大肠杆菌pTASHL/JM109通过发酵进行扩大培养，确定L-Asp的添加对重组工程菌的影响，优化其发酵培养的条件，提高发酵液中的融合蛋白含量。第二部分是从发酵液中提取融合蛋白，通过两种方法对融合蛋白进行分离纯化，比较所得到产物的纯度及回收率，确定纯化条件 1.重组大肠杆菌pTASHL/JM109的发酵扩大培养 （1）配制所需的溶液及培养基。 （2）菌种活化。 在LBA平板上三区划线挑选单菌落，然后在液体培养基中传代培养，培养单菌落，分别挑取10个单菌落在新的10块固体LBA板上传代，标号并倒置培养。 （3）摇瓶培养，测定活性。 对活化的10个单菌落摇瓶培养12h后每瓶接取2%发酵培养，取样离心取上清用凝血酶滴定法测活性。 （4）重组大肠杆菌菌的补料分批发酵。 预处理发酵罐，上罐，对发酵过程中罐压、OD值、pH值、搅拌转速等条件进行控制，监测菌体生长情况，发酵3h后每隔1h取样一次，测量菌体浓度OD600nm和上清液抗凝血酶活性，以此来及时分析大肠杆菌菌体生长情况与产物合成量情况。补料采用的是溶氧反馈控制法。 （5）L-Asp添加时间及添加量的确定 分别在发酵起始期（0 h）、对数生长期（4 h）、对数生长后期（8 h）、稳定期（12 h）添加添加不同浓度的L-Asp。 （6）发酵约24 h左右，终止发酵，将发酵液于4℃，13000rpm离心30 min，取上清分装并标记后，冻存于-20℃。 （7）以L-Asp的浓度为横坐标，酶活为纵坐标绘制0h、4h、8h、12h的标准曲线来确定不同时间添加L-Asp对程菌发酵的影响，并做单因素实验确定L-Asp的添加量对融合蛋白产量的影响。 （8）通过发酵过程中菌体浓度OD600nm和上清液抗凝血酶活性，确定发酵培养温度、溶氧、pH、培养时间及补料原则。 2.对发酵产物进行分离纯化 本课题设计用两种方法种分离纯化的方法纯化目的蛋白。第一种方法将发酵液预处理后，经大孔吸附树脂HP20疏水层析，DEAE-cellulose DE52离子交换层析，RP-FPLC反相层析柱后得到融合蛋白。第二种方法将发酵液预处理后，经大孔吸附树脂HP20疏水层析，SP sepharose fast flow阳离子柱后得到融合蛋白。 2.1 采用大孔吸附树脂HP20—DEAE-cellulose阴离子树脂—制备型C18 RP-HPLC连用的方 法制备融合蛋白 2.1.1用0.22mu;m 超滤膜处理经离心后的发酵上清液，除去上清液中的细胞碎片。 2.1.2将预处理过的大孔吸附树脂HP20装柱并处理,乙酸平衡过夜，然后上样，洗去杂蛋白后，缓冲液洗脱，凝血酶滴定法测活，收集活性组分。 2.1.3将预处理的DEAE-cellulose DE52阴离子树脂装柱并处理。 2.1.4哌嗪平衡处理好的阴离子柱，缓冲液洗脱，凝血酶滴定法测活，收集活性组分。 2.1.5用 RP-FPLC法制备样品，收集活性峰。 2.2 采用大孔吸附树脂HP20和SP sepharose fast flow阳离子树脂结合的方法制备融合蛋白 2.2.1用0.22mu;m 超滤膜处理经离心后的发酵上清液，除去上清液中的细胞碎片。 2.2.2将预处理过的大孔吸附树HP20脂装柱并处理,乙酸平衡过夜，然后上样，洗去杂蛋白后，缓冲液洗脱，凝血酶滴定法测活，收集活性组分。 2.2.3将预处理的SP sepharose fast flow阳离子树脂装柱并处理装好。柠檬酸-NaOH（pH3.0）缓冲液平衡，除盐后上样。缓冲液洗涤后再进行洗脱，收集活性成分。 2.2.4分别对两种方法分离纯化得到的产物进行Tricine-SDS-PAGE分析，纯度分析，比活力测定以及相对分子量测度来选择合适的分理纯化条件。 三、文献综述 癌症是威胁人类健康的主要杀手，我国每年新增癌症患者数居于世界首位，据WHO研究结果表明,癌症死亡患者中有30%~40%是可以预防的，若提前通过如运动、注意饮食等方法可以有效的避免癌症的发生。大豆中含有多种具有活性的抗癌物质，露那辛（Lunasin）是一种最初在发育中的大豆种子的子叶中发现的，由43个氨基酸组成, 相对分子质量为4800的具有抗癌、抗炎、抗氧化等多种生物活性，是一种非常有前景的抗肿瘤多肽，通常使用基因工程的方法获得重组露那辛蛋白。水蛭素是水蛭素(Hirudin)是水蛭及其唾液腺中提取出的活性部分，是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂，是由65-66个氨基酸组成的分子量为7kD的小分子多肽，其理化性质稳定，是一种优良的融合伴侣。将露那辛与水蛭素通过连接肽拼接成融合蛋白进行融合表达，得到水蛭素-露那辛融合蛋白，随后用TEV酶进行酶切，将所得酶切产物进行纯化表达，得到目的蛋白露那辛。以水蛭素为融合伴侣的水蛭素-露那辛融合蛋白，可以使露那辛的表达和纯化更加快速高效，因水蛭素的分子量较小，可以有效增加露那辛蛋白在融合蛋白中的比率，且可增强目的蛋白的稳定性，避免宿主细胞中蛋白酶的降解，提高其产量，并通过测定融合蛋白中水蛭素的抗凝活性实时监测重组融合蛋白的表达水平，追踪其纯化过程。 四、研究计划及预期进展 查阅资料及文献 时间：3.03-3.10 制定实验方案 时间：3.11-3.18 重组大肠杆菌pTASHL/JM109的发酵扩大培养 时间：3.19-4.09 对发酵产物进行分离纯化 时间：4.10-4.30 毕业论文撰写 时间：5.01-5.28 五、参考文献 [1] 王艳红，吴元华，朱春玉等． Diaion HP20 大孔吸附树脂与薄层层析法分离提取嘧肽霉素[J]． 黑龙江八一农垦大学学报， 2005，17 (4)：22–25． [2] 崔莉，谭树华，章良等．重组水蛭素Ⅲ的分离纯化与鉴定[J]． 中国药科大学学报， 2005，36 (1)：78–81． [3] 谭树华，张萍，代广知，徐振雷.一种以水蛭素为融合伴侣制备重组小分子蛋白或多肽的方法[P].中国发明专利：201410048157.1，2014.02.12 [4] Huang C, Zhang X, Qu J, et al. Robust preparative-scale extracellular production of hirudin in Escherichia coli and its purification and characterization. J Ind Microbiol Biotechnol 2012, 39, 1487–1494. [5] Shaohong Wen, Tao Zhang, Tianwei Tan.Utilization of amino acids to enhance glutathione production in saccharomyces cerevisiae.Enzyme and Microbial Technology 35(2004) 501-507. [6] Gayathri s v,Garey M J,et al.Pyrrolysin encode by USG in Archaea:Charging of a UAG decoding specialized tRNA.Science,2002,296(24):1459-1462. [7] Amrein K E, Takacs B, Stieger M. Proc Natl Acad Sci USA. 1995, 92:1048-1052. [8] Darby N J,Morin P E,Talbo G et al.Refolding of bovine pancreatic trypsin inhibitor via non-native disulphide intermediate.J Mol Biol,1995,249:463-477. [9] Park JH, Jeong HJ, Lumen BO. Intro degestibility of the cancer-preventive soy peptides Lunasin and BBI [J]. Agric Food Chem, 2007,55:10703-10706. [10] Tan S, Wu W, Liu J, Kong Y, Pu Y, Yuan R, Efficient expression and secretion of recombinant hirudin Ⅲ in E.coli using the L-asparaginase Ⅱ signal sequence. Protein Expr Purif 2002, 25, 430-436. |
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