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选题目的和意义： 皮肤致敏(过敏性接触性皮炎)是皮肤接触某些小分子化合物而引起的迟发性超敏反应。经典的检测化学物接触致敏性的方法是通过动物试验来检测，鉴于欧盟于2013年颁布全面禁止化妆品动物试验的规定，替代试验将来是化学品/化妆品致敏研究的主要趋势，综合近年的国内外文献，对现行的通过OECD认证的和正在开展研究的皮肤致敏替代试验，如h-CLAT 试验、KeratinoSens TM进行综合论述和评估，为未来体外替代试验能够客观、公正的对致敏结果评估提供参考。 体外方法是不可缺少的生物学检测与研究工具，已普遍用于化妆品法规性测试、生物学机制研究和功效性原料的筛查。体外方法包括法规认可和列入标准测试指南的替代方法，用于风险评估和毒性预测的非生物测试方法，以及大量多元和个性化的方法。这些方法可用于产品监管、原料筛查、配方优化、组合测试和定制化评估，覆盖化妆品质量和安全评价的整个过程。随着全行业共识的形成和应用经验的积累，建立在检测标准基础上的方法创新和优化将不断涌现，这些技术将支撑行业的健康发展，有助于提高竞争力和开发适应消费者需求的产品。 |
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国内外研究状况及发展趋势： 目前还没有一种体外测试方法的结果能完全代替动物试验单独用于化学物皮肤致敏性评估，每一种体外方法只能反应皮肤致敏不良反应结局路径(AOP)中的一部分关键信息，不能完整的反应整个皮肤致敏机制过程。 经过20多年的不断研究和探索，致敏免疫反应分子研究的逐渐清晰，为体外构建可靠的化学物致敏性评价体系奠定了理论基础，随着欧盟相关法规禁止使用动物实验进行化妆品安全性评价的推进，致敏体外替代实验的研究进程也在不断加快，更多的经过欧洲替代方法验证中心( ECVAM) 确认的方法正在得到认可，替代实验的研究具有广阔的前景，我国在替代实验研究方面刚刚起步，应加快替代实验在国内实验室的普及和开展，推动替代实验的不断发展。 近年来，替代方法的发展呈现以下几个趋势。一是研发重点转向更复杂的毒理学领域，如皮肤致敏、肝脏毒性、生殖发育毒性和内分泌干扰等，如2016 年发布的 DPRA、h-CLAT。二是整合评估策略(integrated assessment testing approach，IATA) 的开发，尝试把单一的方法合理科学地组合使用，如眼刺激、皮肤刺激和皮肤致敏的 IATA 处于指南形成的不同阶段。整合策略不仅考虑了现行有效的方法，还加入了 QSAＲ、理化信息、人群暴露等。三是替代方法开发与毒理学新理论紧密结合，研发效率和导向性显著提高，如 有 害 结 局 通 路 ( adverse outcome pathway，AOP)原则的运用，出现了大量新发现和新方法; 四是与风险评估结合，基于大数据的分析，建立从体外数据直接预测人体风险的 模型。 |
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主要研究内容： 对h-CLAT、ARE-Nrf2荧光素酶检测法( KeratinoSens TM)方法进行综合论述和评估，探索实验条件，得出准确数据、指标。 主要研究对象： 人单核白血病细胞 THP-1 ( human monocytic leukaemia cell line) 各项有关指标： CV75（使75%细胞存货受试物浓度）为最高实验浓度。 细胞表面标志物CD86和CD54的表达的变化。 CD54 和 CD86 表达水平用荧光强度均值(Mean Fluorescence Intension，MFI)表示，相比于对照组，实验组 CD54 和 CD86 表达变化情况用 相 对 荧 光 强度(Ｒelative Fluorescence Intensity，ＲFI) 表示。 当受试物RFI86＞150% 或RFI54＞200% 时，判断其具有潜在致敏性。 ＲFI计算公式为: RFI=times;100% 主要研究方法： THP-1细胞与皮肤模型共培养； 共培养皮肤模型组织活率测试（MTT实验）； 暴露受试物； 细胞表面标志物染色； 流式细胞仪检测分析表面标志物的表达变化。 实验方案优化： THP-1为悬浮细胞，较贴壁细胞性能差，且不易计数，我们可以用佛波酯( PMA，0.1mu;g/ml) 诱导，使之转化为具有贴壁能力的THP-1巨噬细胞。 |
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研究难点与重点： 难点：共培养皮肤模型组织活率测试中活细胞的计数； 受试物浓度的设计； 重点：探索THP-1细胞繁殖周期，便于取出其对数期细胞； 探索各种实验所需试剂以及受试物的浓度、条件，建立标准的优良的实验条件标准。 |
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预期实验结果： 通过h-CLAT方法得出准确数据、指标，并且筛选出最优的实验条件。 |
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进度安排： 2019/2/25--2019/3/4 确定论文题目，填写任务书 2019/3/4--2019/3/10 提交开题报告，翻译外文原文资料 2019/3/10--2019/4/8 提交周进展情况记录、中期检查表 2019/4/8--2019/5/20 完成毕业论文初稿 |
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主要参考文献: ［1］Ashikaga T，Yoshida Y，Hirota M，etal.Development of an invitro skin sensitization test using human cell lines: the human Cell Line Activation Test ( h-CLAT)．I．Optimization of the hCLAT protocol［J］． Toxicol in Vitro，2006，20( 5) : 767-773． ［2］ EUＲL ECVAM， Ｒecommendation on the human Cell Line Activation Test (h-CLAT) for skin sensitisation testing［S］．2015．https:/ /eurl-ecvam.jrc.ec．europa．eu /eurl-ecvamrecommendations/ Eurl-ecvam-recommendation-on-the-humancell-line-activation-test-h-clat-for-skin-sensitisation-testing． ［3］ OECD． OECD Guideline for the testing of chemicals draft proposal for a new test guideline，In vitro skin sensitization:human cell line activation test (h-CLAT)［S］．Paris: OECD，2015． https: / /www． oecd． org /env/ehs/testing/151216-Draft-hCLAT-TG-After-Expert-Meeting-(clean) -Final.pdf ［4］陈宁,王平,冼静雯,谢天柱,秦美容,李俊鹏,鲁艺,王晓炜,石海宁,龙绍蓉.皮肤致敏试验替代方法的研究进展[J].中国比较医学杂志,2016,26(12):85-90. ［5］陈健,柯逸晖,谈伟君.基于皮肤模型与THP-1细胞共培养建立皮肤致敏体外检测方法的初步研究[J].日用化学工业,2018,48(05):288-292. ［6］陈彧,喻欢,秦瑶,程树军,谈伟君.基于THP-1细胞的皮肤致敏体外检测方法[J].中国比较医学杂志,2017,27(04):94-102. ［7］赵雪铮,贾强,张峻,李雪,郑玉新,张艳淑,戴宇飞.利用THP-1细胞进行致敏物鉴定的方法验证[J].卫生研究,2014,43(03):397-404. ［8］程树军,秦瑶,柯逸晖,陈志杰,黄健聪.替代方法在化妆品检测中的应用分析[J].中国比较医学杂志,2017,27(10):101-106. |
