姓名

左春晓

学号

16406505

专业

中药资源与开发

指导教师

寇俊萍

课题名称

人参皂苷Rb1改善缺血性脑卒中诱导的肠屏障破坏的研究

课题性质

radic; 基础研究 应用课题 设计型 调研综述 理论研究

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

开题报告

一、研究目的

缺血性脑卒中（Cerebral ischemic stroke）是全球第二大致死原因，将影响至少六分之一的人口，具有显著的发病率和死亡率。脑卒中应激引起的消化道症状在临床上很常见，如腹胀、便秘等。但是有关急性缺血性脑卒中对肠粘膜屏障影响的规律和机制缺乏系统深入的研究。大量研究表明，传统中药人参具有大补元气，益气摄血，复脉固脱的功效；同时，课题组前期研究发现，人参的主要活性成分人参皂苷Rb1能够明显改善缺血性脑卒中引发的神经元死亡，具有明显的脑保护作用。也有研究表明人参皂苷Rb1能够保护肠粘膜屏障在腹膜空气暴露的实验模型中。但目前人参皂苷Rb1能否在改善血脑屏障，同时进而保护肠屏障的完整性，达到多器官保护的效果未见报道。本课题从脑肠相互联系入手，以经典的脑缺血再灌注MCAO/R模型为基础，探讨脑屏障破坏对肠屏障的影响，和研究人参皂苷Rb1在MCAO/R模型中，对脑肠屏障的保护作用。以期为脑肠联系的中医理论提供实验依据，并为阐释人参皂苷Rb1改善脑缺血再灌注诱发的肠屏障提供新的实验证据。

1. 拟研究或解决的问题
2. 小鼠在MCAO/R诱导后脑肠屏障的变化，和肠损伤的相关指标的变化。
3. 人参皂苷Rb1对MCAO/R诱导后的脑肠屏障的保护作用及相关紧密连接诶蛋白的表达。

三、研究手段及内容

1、制备小鼠脑缺血再灌注模型：动物仰卧固定，切开颈部皮肤，暴露其右侧颈总、颈内及颈外动脉，在近心端结扎颈总动脉，在颈动脉分叉处结扎颈外动脉，然后在颈总动脉结扎处远心端剪一小切口，插入无菌尼龙单丝至Willis环，堵住大脑中动脉入口。1小时后，取出尼龙单丝，缝合伤口。

2.体内实验：拟采用尾静脉注射伊文思蓝法观察假手术，模型组和给药组中小鼠脑肠组织屏障通透性变化，并用HE检测脑肠病理变化，TTC染色确定脑梗死面积，激光散斑多普勒血流仪测定肠血流量变化。

3.免疫荧光检测脑肠组织中紧密连接蛋白的表达。

四、成果形式

成果将以基础研究论文的形式呈现。

五、工作进度（视疫情情况和开学时间做调整）

第一阶段（2020.3月）：学习基本动物实验操作及方法，准备预试验；

第二阶段（2020.4月-2020.5月初）：完成脑缺血再灌注模型的建立，和伊文斯兰渗漏试验，以及TTC检测脑梗死面积和HE检测脑肠的病理变化；

第三阶段（2020.5月初-2020年6月）：完成激光散斑多普勒血流仪测定肠血流量变化，以及免疫荧光检测脑肠组织中紧密连接蛋白的表达。最后完成数据整理及毕业论文的撰写。

五、文献综述

脑缺血再灌注引起多器官损伤的研究进展

摘 要：脑缺血是由于栓塞等原因导致脑内动脉闭塞，脑组织不能够得到足够的血液以维持新陈代谢，从而引起组织损伤及器官损伤的一类缺血性脑血管疾病。在经积极治疗，恢复缺血区血流再灌注之后，常常继发心肌梗塞，肺水肿，急性胃粘膜病变，肾功能衰竭及代谢等系统或多器官的损伤。本文就近年来脑缺血再灌注引起的多器官损伤及其中药治疗的研究进展做一综述。

关键词：脑缺血再灌注；多器官损伤；中药治疗

脑缺血再灌注损伤（Cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI）是一种复杂而广泛的病理生理过程，指缺血性脑血管疾病造成损伤后，经过积极的治疗实现缺血区血流再灌注，损伤情况没有得到缓解，反而进一步加重并影响众多远隔器官的现象^[1]。

1. 脑缺血再灌注对多器官的损伤

溶栓治疗（Thrombolytic therapy）是作为治疗缺血性脑血管疾病，例如脑梗死、脑血栓等的最常用方案，在特定的治疗窗中能够尽早恢复缺血区的血流再灌注，挽救缺血组织，具有较为可观的临床疗效^[2-6]。但随着此方案临床使用经验的积累，医生和学者们逐渐意识到，脑组织缺血一定时间后，再恢复血液灌注将影响视丘下部植物神经中枢并导致全身出现的神经性应激反应，使交感神经系统紧张性增强，并加速儿茶酚胺合成和释放，引起全身各脏器小动脉痉挛或收缩，使脏器缺血而受到损伤。如李建生等^[7-8]的研究明确表明，在大龄老鼠CIRI模型上，脑缺血再灌注可能导致多个器官，如心、肺、肝、肾、肠黏膜屏障等的损伤。

1.1肺脏损伤 据文献报道^[9]，急性脑血管病并发急性肺损伤（Acute lung injury）后肺组织呈现明显的炎症反应、氧化应激损伤、离子转运障碍等现象，肺组织表现出肺泡壁增厚，泡壁周围染色模糊，血管扩张，腔内有明显渗出物，大量TUNEL染色凋亡细胞等现象。

1.2心脏损伤 研究^[10]表明，急性脑缺血再灌注常同时或接续发生心脏损伤，这种由脑血管疾病导致的继发性心功能损伤称为脑心综合征（Cerebral cardiac syndrome）。此类心脏损伤临床上常表现为心律失常，心肌缺血，假性心肌梗死，心力衰竭甚至心脏停搏等一系列心脏并发症。

1.3肝脏损伤 脑缺血再灌注引发的肝脏的损伤主要表现为：脂肪变性，嗜酸细胞增多，代谢紊乱等，且血清中转氨酶明显增高，目前认为其机制与氧化应激密切相关^[11]。

1.4肾脏损伤 普遍认为脑缺血再灌注也会产生一定程度的继发性肾脏损伤，且有证据表明，这种损伤不仅表现为肾小球滤过功能的损伤，同时肾小管也有一定程度的病变。其损伤产生的机制尚不明确，推测与急性缺血导致的应激状态激素水平变化有关，或与氧自由基的活动及神经肽的失衡也有联系^[12]。

1.5肠损伤 啜佳然等^[13]利用改良的Longa法建立大鼠大脑中动脉闭塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型，在光镜及电镜下观察到肠粘膜上皮细胞受损，证明缺血早期肠粘膜屏障即可发生应激性损害。张芯等^[14]在MCAO后小鼠的病理学检测中发现其结肠黏膜出现局部损伤甚至剥脱，说明MCAO后，肠道黏膜局部组织结构出现损伤，肠黏膜完整性受损，为肠道内容物入血提供了条件。电镜结果亦显示结肠紧密连接疏松，间隙增宽。

1. 脑缺血再灌注引起多器官损伤的机制

脑缺血再灌注引起的继发多器官损伤是一个复杂病理过程，各器官损伤的机制不尽相同，但总体与炎症反应、氧自由基等因素相关。

2.1肺损伤机制 吕燕妮等^[10]研究发现脑缺血再灌注后肺部的炎症响应极其迅速，老年小鼠组肺组织HE染色显示在再灌注1 h后，肺部组织就有明显变化，说明脑缺血再灌注时极易并发肺损伤。目前对于脑缺血再灌注后发生急性肺损伤的机制并不十分明确，认为急性肺损伤是多种因素共同作用所致，例如氧自由基的形成、肿瘤坏死因子alpha;（tumour necrosis factor-alpha;，TNF-alpha;）、内皮素（endothelin，ET）、一氧化氮（nitric oxide，NO）和中性粒细胞的变化等^[7]。

2.2心损伤机制 心脏的调节中枢位于下丘脑，脑干，边缘系统等，其受交感、副交感神经的支配，当发生脑缺血再灌注损伤时，导致心血管神经中枢的调节功能紊乱，发生心律失常等病变^[15]。^]根据吕燕妮^[10]等人的实验，脑缺血再灌注过程心脏ATP酶活性降低，心脏组织核因子NF-kappa;B ( nuclear factor kappa;B）途径激活并释放炎症因子，也是出现心脏损伤和心肌细胞凋亡的重要机制之一。

2.3肝损伤机制 研究^[16]认为脑缺血再灌注后引起肝损伤的机制与氧化应激密切相关。脑缺血再灌注后组织缺血缺氧，自由基大量生成，致使内环境紊乱，组织细胞损伤，大量炎症因子释放入血，作用于肝脏，进而发生一系列病理损伤。且有实验通过向脑缺血再灌注小鼠体内注射示踪剂,测定各组织中的含量，发现肝脏是有害物质聚集最高的器官之一，表明肝脏是脑缺血再灌注损伤后非常敏感的脏器之一^[16-19]。

2.4肾损伤机制 伍丽娜等^[20]研究结果表明缺血再灌注过程中,氧自由基生成增多和(或) 清除减少,是脑缺血再灌注引起的肾组织损害主要机制之一，另外随着脑缺血再灌注损伤时间延长，模型组大鼠肾组织NF-kappa;B表达逐渐增强，推测脑缺血再灌注损伤所产生的氧化应激反应可能导致核因子NF-kappa;B的抑制蛋白（Ikappa;B）被磷酸化和降解，胞质内NF-kappa;B与Ikappa;B分离并活化进入细胞核并结合于DNA，从而启动基因转录，NF-kappa;B激活后可促进炎性介质释放，促进中性粒细胞向病灶聚集，也是对肾组织造成损害的机制之一。

2.5肠损伤机制 刘业成等^[21]的研究认为急性缺血性脑卒中将引起肠黏膜紧密连接蛋白闭锁蛋白和闭锁小带蛋白1的表达降低，从而导致紧密连接破坏，是肠屏障功能障碍的重要分子机制之一。肠黏膜细胞凋亡上调是肠屏障障碍的细胞学基础，凋亡是缺血性脑卒中时肠上皮细胞死亡的重要形式。张芯等^[14]通过实验证明脑缺血再灌注导致的肠屏障损伤除了与紧密连接蛋白的表达降低有关，也与肠道菌群失调及菌群移位等变化有关。

1. 中药对脑缺血再灌注引起多器官损伤的治疗作用

据近年来国内外文献报道，许多中成药单体成分如人参皂苷、川芎嗪，提取物如香椿子正丁醇提取物，以及部分中药复方如益元活血丹等，对脑缺血再灌注引起的多器官损伤具有一定的保护作用。

根据胡敏等人^[22]的实验，我们得知香椿子正丁醇提取物可通过其抗氧化应激效应对脑缺血介导的多器官功能障碍综合征发挥保护作用，并且以肝肺保护作用最为显著。李建生等经多次实验证实，川芎嗪和参麦注射液及其配伍、对老龄大鼠脑缺血再灌注引起多个器官损伤均有不同程度不同方面的保护作用，其机制或与抑制交感肾上腺系统兴奋增强有关^[8]；另外补肾活血 ,泻下及开窍活血方药大黄和益元活血丹也有相似作用，且机制亦与抑制交感肾上腺系统兴奋增强有关^[23]。

1. 展望

缺血性脑血管疾病如脑梗死、脑血栓形成等可使某些器官功能损伤乃至衰竭，并由此导致连锁反应，发生多器官功能损伤乃至衰竭，其中以心，肝，肺，肾，胃肠为容易受累，典型表现为心肌梗死，肝细胞水肿，肺水肿，急性胃黏膜病变，肾功能衰竭及代谢紊乱等，病死率与器官衰竭数目呈正相关，各器官功能衰竭加重原有脑部病灶的损伤，并可使机体各器官进一步受累，如此形成恶性循环，甚至导致死亡。因此，开展脑缺血再灌注多器官损伤机制的研究，积极探讨脑缺血疾病引起的多器官损伤的药物治疗和预防具有重大医学价值和社会意义。

参考文献

1. Laura Dorado,Monica Millaacute;n,Antoni Daacute;valos. Reperfusion therapies for acute ischemic stroke:an update [J]. Curr Cardiol Rev,2014,10(4):327-335.
2. Von Kummer R, Allen KL, Holle R, Bozzao L, Bastianello S, Manelfe C, Bluhmki E, Ringleb P, Meier DH, Hacke W. Acute stroke: usefulness of early CT findings before thrombolytic therapy[J]. Radiology,1997,205(2):327–33.
3. Hacke W, Donnan G, Fieschi C, Kaste M, von Kummer R, Broderick JP, Brott T, Frankel M, Grotta JC, Haley EC Jr, et al. Association of outcome with early stroke treatment: pooled analysis of ATLANTIS, ECASS, and NINDS rt-PA stroke trials[J]. Lancet. 2004;363(9411):768–74.
4. Lees KR, Bluhmki E, von Kummer R, Brott TG, Toni D, Grotta JC, Albers GW, Kaste M, Marler JR, Hamilton SA, et al. Time to treatment with intravenous alteplase and outcome in stroke: an updated pooled analysis of ECASS, ATLANTIS, NINDS, and EPITHET trials[J]. Lancet. 2010;375(9727):1695–703.
5. NINDS-rtPA: Tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA stroke study group[J]. N Engl J Med. 1995;333(24):1581–7.
6. Kwiatkowski TG, Libman RB, Frankel M, Tilley BC, Morgenstern LB, Lu M, Broderick JP, Lewandowski CA, Marler JR, Levine SR, et al. Effects of tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke at one year. National Institute of Neurological Disorders and Stroke recombinant tissue Plasminogen activator stroke study group[J]. N Engl J Med. 1999;340(23):1781–7.
7. 赵薇,王树,李方江.脑缺血再灌注引起多器官损伤的研究进展[J].神经药理学报,2014,4(02):55-63.
8. 李建生,李建国,赵君枚.川芎嗪和参麦注射液对老龄大鼠脑缺血再灌注多器官损伤的作用 [J]. 中国中西医结合急救杂志,2000,7(5):289-294
9. 于涓,林艳婷. Zileuton 对局灶性脑缺血再灌注致急性肺损伤的保护作用[J]. 中国药理学通报,2009,25(11):1460- 1465.
10. 吕燕妮,付龙生,钱贻崧.青年和老年小鼠脑缺血再灌注心肺损伤的机制[J].细胞与分子免疫学杂志,2017,33(06):800-806.
11. 曹勇军,钱进军,刘春风.老龄大鼠急性脑缺血再灌注对心肌组织的影响[J]. 中国临床神经科学,2005,13(4):365-368.
12. 王灿,王琳琳,苗明三.脑买书康胶囊对沙土鼠脑缺血再灌注损伤的影响[J]. 中华中医药杂志,2014,29(7):2352-2355.
13. 啜佳然,朱玉群,徐立新,袁芳,徐有青,王晨.缺血性脑卒中大鼠肠黏膜的损害及小肠运动功能障碍[J].首都医科大学学报,2010,31(03):310-314.
14. 张芯,郭卿,王斌苏,杨国红,蔡伟,牛秀珑,姬文婕,杨宁,周欣,李玉明.小鼠急性脑缺血再灌注损伤后消化道不同肠段通透性的改变[J].解放军医学杂志,2019,44(04):271-275.
15. 李洋阳,吴卫娟,孟然.脑梗死并发脑心综合征的研究进展[J].中华临床医师杂志(电子版),2017,11(01):91-94.
16. 范红斌,邱丽颖,李英.脑缺血再灌注时肝脏损伤的形态学变化及阿司匹林的保护作用 [J]. 中国老年学杂志,2011,31(7):2513-2514.
17. 丁库克,曾衍钧,胡金麟,等.脑缺血及再灌注对脑微血管通透性及肺等脏器的影响 [J]. 北京工业大学学报,2000,26(1): 37-41.
18. 牛文民,刘智斌,杨晓航.针刺保肝护脑对脑缺血再灌注肝损伤大鼠 gamma;- 谷氨酰半胱氨酸合成酶表达的影响 [J]. 广州中医药大学学报,2012,29(5):537-541.
19. Mabel M Cortes-Wanstreet,Erich Giedzinski,Charles L Limoli,et al. Over expression of glutamate-eysteine ligase protects human COV434 granulosa tumour cells against oxidative and gammaradiation-induced cell death [J]. Mutagenesis,2009,24(3):211.
20. 伍丽娜,苏炳银,赵海霞.褪黑素对脑缺血再灌注模型大鼠继发肾损伤的影响[J].广东医学,2017,38(17):2601-2606.
21. 刘业成,何桂珍,齐志伟.缺血性脑卒中对犬肠屏障功能的影响[J].中华临床营养杂志,2012,20(4):234-237.
22. 胡敏,陈超,周聪,游艳,何治.香椿子正丁醇提取物对脑缺血后肝肺损伤的保护作用研究[J].时珍国医国药,2014,25(07):1560-1562.
23. 李建生,李建国,赵君玫.补肾活血、泻下及开窍活血方药对老龄大鼠脑缺血再灌注多器官损伤的保护作用[J].河南中医,2000(03):13-16。

学生签名： 年 月 日

指导教师意见：

指导教师签名： 年 月 日

所在教研室（实习单位）审查意见：

负责人签名： 年 月 日