阿江榄仁酸对FFA诱导的HepG2脂质蓄积的改善作用及机制研究文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

1 研究背景

1.1 非酒精性脂肪肝

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是最常见的慢性肝病病因之一。Jie等^[1]从PubMed、EMBASE以及Cochrane Library三个数据库中采集了4995项自1999年至2019年间关于研究亚洲NAFLD的文献记录。数据分析结果显示，亚洲NAFLD二十年间患病率为29.62% (28.13-31.15)，肝细胞癌变发生率为0.18% (0.08-0.31)。同时，患病率呈逐年上升趋势，1999年至2005年间患病率为25.28% [22.42-28.37]，2006年至2011年间患病率为28.46% [26.70-30.29]，2012年至2017年间患病率为33.90% [31.74-36.12]。由此可见，随着国人生活水平的不断提高，NAFLD已严重影响人们的日常生活，甚至威胁到生命健康。

NAFLD具有阶段进展性，初始阶段为良性肝脏脂肪变性，随后可逐渐发展为非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)、肝硬化，甚至是肝癌，同时可伴随心血管疾病和代谢性疾病的发生。公认的NAFLD发病机制为“二次打击”假说，该假说认为肝脏脂肪变性是对肝脏的“第一次打击”，随后氧化应激、炎症反应、胰岛素抵抗等其他因素介导对肝脏的“第二次打击”，并诱导NASH的发生。随着研究的不断深入，研究者们发现，NAFLD并不仅仅由肝脏脂肪变性引起，还可能与饮食习惯、肠道菌群等其他因素有关。由此，在“二次打击”学说基础上，研究者进一步提出更为科学的“多重打击”假说^[2]。

截至2020年2月4日，在美国临床试验数据库(https://clinicaltrials.gov/)中，以NAFLD为关键词在“Condition or disease”项中搜索，共有815项关于NAFLD的临床研究，其中美国为323项，中国为42项，此外处于4期临床试验并获得结果的研究共有7项（见表1），但是没有任何一种针对NAFLD的药物获批上市。

表1：7项处于4期有结果的临床试验

1.2 青钱柳及其活性成分

中药是中国古代劳动人民智慧的结晶，是大自然给予人类的宝库。在化学药物针对NAFLD的临床试验未取得显著进展的时候，中药或许可以为研究者提供新的思路。近年来，研究者发现许多中药、中药提取物或中药活性单体成分具有良好的肝脏保护作用，能够有效预防或治疗肝脏疾病。例如，香椿树皮与果实提取物^[3]可通过激活肝脏AMPK信号通路，下调脂质合成相关蛋白表达量，增加自噬流，从而促进肝脏脂质代谢；白藜芦醇^[4]可通过cAMP-PRKA-AMPK-Sirt1信号通路诱导自噬，从而改善肝脏脂肪变性；小檗碱^[5]在小肠中可通过抑制胆盐水解酶(BSH)，升高牛磺胆酸(TCA)，激活FXR，从而抑制Cd36在肝脏的表达，导致肝脏对长链脂肪酸的摄取减少；水飞蓟宾^[6]可通过NAD /SIRT2途径抑制HFD诱导的NAFLD小鼠NLRP3炎性小体组装。由此可见中药在NAFLD药物研发中占有举足轻重的地位，本课题将从中国特有珍稀植物青钱柳出发，旨在探讨青钱柳中主要成分对NAFLD的改善作用。

青钱柳(Cyclocarya paliurus (Batalin) Iljinsk)，胡桃科青钱柳属植物，又名青钱李（浙江），山麻柳（湖北、湖南），山化树（安徽）等，分布于安徽、江苏、浙江、江西、福建、台湾、湖北、湖南、四川、贵州、广西、广东和云南东南部，常生长在海拔500-2500米的山地湿润的森林中，为我国特有的珍稀植物，列入二级保护植物名单^[7]。青钱柳叶常作为茶饮，甘甜滋润，具有生津止渴、清热解毒的功效。现代研究表明，青钱柳叶中富含多糖、黄酮、三萜及其皂苷类等成分，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗肿瘤等药理活性^[8]。

青钱柳提取物可通过多种途径调节肝脏脂质代谢，预防并治疗NAFLD。青钱柳醇提物可下调apoB48表达，抑制TNF-alpha;分泌和MAPK磷酸化，发挥降脂作用^[9][10]。其氯仿提取物可激活AMPK，促进胰岛素缺乏情况下对葡萄糖的摄取并显著抑制炎症^[11]，也可抑制肝脏脂肪从头合成改善肝脂肪变性^[12]。青钱柳叶提取物可通过提高CYP7A1活性，降低HMG-CoA还原酶活性及其mRNA水平，进而促进胆固醇转化为胆汁酸，减少胆固醇的生物合成^[13]。

Liu等^[14]在对青钱柳各类化学成分的药理作用研究中发现，青钱柳提取物中黄酮类成分具有较好的降血糖作用，其中槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷和山奈酚-3-O-葡萄糖醛酸苷含量较高；青钱柳三萜类成分含量与血脂水平呈显著负相关，表明三萜类成分具有较好的降血脂作用。Zhao等^[15]发现青钱柳三萜酸可通过激活Nrf2保护线粒体功能，改善氧化应激。Jiang等^[16]发现青钱柳三萜富集部位可通过Rho激酶信号通路减轻肝脏炎症。Zheng等^[17]发现青钱柳三萜富集部位可通过PI3K-Akt-GSK3beta;通路改善胰岛素抵抗，抑制肝脏脂肪变性，其中阿江榄仁酸含量最高，峰面积占比约为41%。

2, 3, 23-三羟基齐墩果-12-烯-28-酸（见图1），又称阿江榄仁酸(arjunolic acid)，其相对分子量为488.70，广泛分布于青钱柳、香茶菜、木通、金樱子等植物中，具有抗心肌纤维化、抗氧化、抗肿瘤等药理活性。Manna等^[18]发现阿江榄仁酸可抑制ROS, RNS, HbA(1C), AGEs的形成，改善氧化应激，起到预防和抑制肝细胞凋亡的作用。Toppo等^[19]发现阿江榄仁酸可上调肝脏PPARalpha;和FXRalpha;的表达，同时下调PPARgamma;的表达，改善肝脏脂肪变性，减少MNC浸润，对NAFLD具有潜在的治疗作用。

图1：阿江榄仁酸

沉默信息调节因子1 (silent mating type information regulation 2 homolog 1, Sirt1)是一种NAD 依赖的组蛋白去乙酰基酶，在基因转录、细胞周期及糖脂代谢调节中起着重要作用。报道显示，Sirt1可通过调节线粒体生物合成并促进脂肪酸beta;-氧化，减轻炎症反应，在维持糖脂代谢稳态及改善胰岛素敏感性的过程中发挥关键作用。既往研究发现，激活肝脏中的Sirt1可以缓解高脂饮食(HFD)诱导的代谢损伤。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP–activated protein kinase, AMPK)作为一种细胞能量感受器，在能量稳态调节中起到关键作用。AMPK由AMP变构激活，同时受到ATP的调控，低水平ATP可激活AMPK。激活的AMPK通过增强脂肪酸氧化及自噬过程，抑制糖异生、脂质和蛋白质合成，进而增加ATP的生成，减少其消耗。鉴于AMPK是糖脂代谢的主要调控分子，因此可作为2型糖尿病、肥胖症和NAFLD的潜在治疗靶点。

综上所述，青钱柳对NAFLD具有较好的治疗作用，探讨其中主要单体成分对NAFLD的治疗具有重要的临床意义。

2 实验目的及意义

基于课题组前期研究，选择青钱柳叶中的主要成分——阿江榄仁酸，研究其对游离脂肪酸(FFA)诱导的HepG2细胞脂质蓄积的改善作用及机制，为NAFLD的治疗提供理论依据。

3 实验内容

3.1 MTT实验测定细胞活力

将HepG2细胞以1times;10⁴ cells/well的密度接种于96孔板中，培养过夜。次日使用不同浓度阿江榄仁酸（0、5、10、20、40、80 mu;M），FFA（0、0.0625、0.125、0.25、0.5、1 mM）及阿江榄仁酸（10、20、40 mu;M）与FFA（0.5 mM）共孵育处理24 h，对照组使用不含药物的空白培养基处理细胞，以只加入培养液，不加入细胞和药物的组为空白组。孵育结束后，每孔加入MTT母液（5 mg/ml）20 mu;l，37℃孵育4 h，用DMSO充分溶解甲臜，多功能酶标仪测定490 nm处吸光度（OD）值，用空白孔校准，计算细胞相对活力。

3.2 油红O染色

将HepG2细胞以2times;10⁵ cells/well的密度接种于6孔板中，培养过夜。次日使用不同浓度阿江榄仁酸（10、20、40 mu;M）与FFA（0.5 mM）共孵育处理24 h。处理结束后，弃去培养基，PBS洗涤3遍，4%多聚甲醛室温固定20 min，双蒸水洗涤3次，油红O室温染色30 min，双蒸水洗涤3次，苏木精复染5 min，利用光学显微镜观察脂滴并拍照。各孔分别加入异丙醇孵育10 min，540nm测定光密度。

3.3 TG检测试剂盒测定细胞内TG含量

HepG2细胞药物处理24 h后，弃去培养基，PBS洗涤3遍，细胞刮收集细胞后超声裂解，参照试剂盒说明书测定细胞内TG含量。BCA法测定细胞裂解液的蛋白浓度，并用蛋白浓度校正TG数值，TG含量以（mmol/g.protein）表示。

3.4 Western blot检测Sirt1/AMPK信号通路的变化

HepG2细胞药物处理24 h后，细胞刮收集细胞，RIPA强裂解液冰上裂解30 min，4℃ 12000 rpm离心15 min，用BCA法测定上清液蛋白浓度。采用10% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，将蛋白电转移至PVDF膜上，5% BSA室温封闭1 h后，分别使用一抗4℃孵育过夜，HRP标记二抗室温孵育2 h，采用ECL显色液显色，用IPP 6.0软件进行定量分析。

3.5 统计学方法

应用SPSS22.0软件进行统计分析，计量资料以xplusmn;s表示，多组间比较采用单因素方差分析 (one-way ANOVA)，组内两两比较使用Student-Newman-Keuls (SNK)检验。P lt; 0.05表示差异有统计学意义。

【参考文献】

1. Li J , Zou BY , Yeo YH , et al. Prevalence, incidence, and outcome of non-alcoholic fatty liver disease in Asia, 1999–2019: a systematic review and meta-analysis[J]. The Lancet Gastroenterology amp; Hepatology, 2019. 10.1016/S2468-1253(19)30039-1
2. Friedman SL , Neuschwander-Tetri BA , Mary R , et al. Mechanisms of NAFLD development and therapeutic strategies[J]. Nature Medicine, 2018, 24(7):908-922.
3. Chen YC, Chen HJ, Huang BM, et al. Polyphenol-Rich Extracts from Toona sinensis Bark and Fruit Ameliorate Free Fatty Acid-Induced Lipogenesis through AMPK and LC3 Pathways[J]. Journal Of Clinical Medicine, 2019, 8(10):1664
4. Zhang Y, Chen ML, Zhou Y, Yi L, Gao YX, Ran L, et al. Resveratrol improves hepatic steatosis by inducing autophagy through the cAMP signaling pathway[J]. Molecular Nutrition amp; Food Research, 2015, 59(8):1443-1457.
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18. Manna P , Das J , Ghosh J , et al. Contribution of type 1 diabetes to rat liver dysfunction and cellular damage via activation of NOS, PARP, Ikappa;Balpha;/NF-kappa;B, MAPKs, and mitochondria-dependent pathways: Prophylactic role of arjunolic acid[J]. Free Radic Biol Med, 2010, 48(11):1465-1484.
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开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

1 研究背景

1.1 非酒精性脂肪肝

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是最常见的慢性肝病病因之一。Jie等^[1]从PubMed、EMBASE以及Cochrane Library三个数据库中采集了4995项自1999年至2019年间关于研究亚洲NAFLD的文献记录。数据分析结果显示，亚洲NAFLD二十年间患病率为29.62% (28.13-31.15)，肝细胞癌变发生率为0.18% (0.08-0.31)。同时，患病率呈逐年上升趋势，1999年至2005年间患病率为25.28% [22.42-28.37]，2006年至2011年间患病率为28.46% [26.70-30.29]，2012年至2017年间患病率为33.90% [31.74-36.12]。由此可见，随着国人生活水平的不断提高，NAFLD已严重影响人们的日常生活，甚至威胁到生命健康。

NAFLD具有阶段进展性，初始阶段为良性肝脏脂肪变性，随后可逐渐发展为非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)、肝硬化，甚至是肝癌，同时可伴随心血管疾病和代谢性疾病的发生。公认的NAFLD发病机制为“二次打击”假说，该假说认为肝脏脂肪变性是对肝脏的“第一次打击”，随后氧化应激、炎症反应、胰岛素抵抗等其他因素介导对肝脏的“第二次打击”，并诱导NASH的发生。随着研究的不断深入，研究者们发现，NAFLD并不仅仅由肝脏脂肪变性引起，还可能与饮食习惯、肠道菌群等其他因素有关。由此，在“二次打击”学说基础上，研究者进一步提出更为科学的“多重打击”假说^[2]。

截至2020年2月4日，在美国临床试验数据库(https://clinicaltrials.gov/)中，以NAFLD为关键词在“Condition or disease”项中搜索，共有815项关于NAFLD的临床研究，其中美国为323项，中国为42项，此外处于4期临床试验并获得结果的研究共有7项（见表1），但是没有任何一种针对NAFLD的药物获批上市。

表1：7项处于4期有结果的临床试验

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