开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
课题背景
乏氧是一种由供氧不足引起的病理状态，乏氧细胞是指其氧张力低至不能维持增殖而又不至于死亡的静止细胞，乏氧细胞具有放射和化学毒剂抗性，一旦再氧合即恢复增殖能力[1]。现有的可以检测乏氧技术的方法包括磁共振成像(MRI)[2-3]，正电子发射断层扫描(正电子发射断层扫描)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)[4]及荧光探针技术[5]。
荧光探针技术是一种借助探针分子的光物理和光化学性质对微环境变化的敏感性在分子水平上研究生物体内结构变化的方法。荧光探针技术方法多样、直观性强、灵敏度高、检测快速，因而成为细胞组织水平研究的重要手段。[6]
荧光探针可按发光机理不同可以分为以下几类:光诱导电子转移（PET）、分子内电荷转移（ICT)、激发态分子内质子转移（ESIPT)、聚集荧光增强（AIEE)、电子能量转移（EET)、荧光共振能量转移（FRET）等[7]。在本课题中我们采用的就是经典的PET探针，由荧光集团、连接基团和识别基团三部分组成。识别基团是与检测底物特异性识别的基团，在反应过程中，识别基团与被分析物的选择性作用，研究者可通过设计并合成识别基团并将其引入到反应体系中，从而设计出性能优越的新型荧光探针；连接基团用以连接识别基团和荧光基团，在识别基团与被分析物结合后，连接基团将识别信息传递给荧光基团，从而产生荧光信号的变化[8]。由于PET过程前后荧光变化类似于OFF—ON开关，因此这类荧光探针也被称为荧光分子开关[9]。
乏氧荧光探针技术为荧光探针技术的一种，已报导的乏氧荧光探针主要分为以下两种：1.硝基咪唑型荧光探针，1991年，Hodgkiss研究组最先报道了3-硝基萘二酰亚胺类乏氧细胞荧光探针，但因其硝基还原不完全或还原荧光化合物在乏氧细胞中潴留时间过短使其荧光强度比不大，因此探针灵敏度不高且成本较大[10]；2.偶氮苯还原型荧光探针，Nagano课题组合成了一种利用偶氮苯还原的用于乏氧检测的FRET型探针，此探针能够在体外鉴别乏氧，而且可以对老鼠体内缺血性组织进行荧光成像并且荧光响应迅速[11]。
从前面的分类分析和再次查阅文献可以知道，偶氮还原苯型探针具有优良的性能，偶氮化合物在乏氧条件下，可以被还原酶还原成氨基而产生荧光化合物[12]，发出荧光，这意味着偶氮化合物在很大程度上能帮助AKI、肿瘤组织乏氧状态的评估[13]，但目前有关乏氧探针技术的研究大多数都处于初级阶段[14-15]，因此加大对乏氧荧光探针的研究力度显得尤为重要。体外细胞实验是从微观角度（细胞水平）来探讨乏氧荧光探针的摄取与作用，是所设计的探针能应用于活体的基础。
本课题拟在乏氧状态下，设计偶氮还原酶、NADH响应的分子荧光探针作用于细胞，使细胞释放出荧光分子，从而实现对乏氧的检测。
- 要解决的问题
- 乏氧荧光探针在乏氧环境下与偶氮还原酶、NADH作用产生荧光的机制。
- 将合成的乏氧荧光探针应用于细胞并产生可供定性、定量乏氧状态的荧光。
- 将乏氧荧光探针通过低分子量壳聚糖包裹形成的纳米粒子作用于细胞，对其水溶性和生物相容性的研究。
- 乏氧荧光探针应用于不同细胞的检测及对细胞选择性的验证。
- 可行性分析
- 现有检测乏氧的手段灵敏度较低，成本较高，因此需设计高灵敏度的乏氧荧光探针来对乏氧进行定性、定量分析。
- 还原酶作用于荧光探针切断偶氮化合物偶氮键，使荧光分子产生荧光已被报导。[16]
- 研究思路和内容
分子探针技术因具有灵敏度高，选择性好，使用方便，成本低等优点，越来越成为现代精准医疗的重要手段。
乏氧状态下，细胞内还原酶可作用于偶氮化合物的偶氮键，使偶氮键断裂形成有荧光的RNH1及RNH2。这成为我们设计还原酶响应的分子荧光探针的依据与基础。
在整理现有报道的有关分子探针的设计原则的文献之后，拟以荧光素为发色团，以偶氮键为乏氧响应基团，设计合成乏氧荧光探针。因偶氮基团的淬灭作用，导致荧光分子荧光减弱。在乏氧环境下，偶氮化合物透过乏氧细胞脂膜，在偶氮还原酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的作用下，偶氮基被还原为氨基，通过电子转移反应，响应基团与荧光分子发生断裂，释放出荧光分子，从而实现对乏氧的检测。此外，通过低分子量壳聚糖包裹形成纳米粒子，来增大其水溶性和生物相容性，并避免探针被清除和猝灭，以应用于不同细胞乏氧的检测。在乏氧状态下探针由“off”状态转变为“on”状态，从而使荧光探针定性、定量乏氧成为可能。
