1.研究背景
血管内皮生长因子（VEGF）在肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用。VEGF通过血管内皮细胞表面血管内皮生长因子受体-2 (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2,VEGFR-2)激活下游信号，可诱导内皮细胞的生长、迁移和管状形成，促进新生血管形成、提高血管通透性，满足肿瘤细胞对氧和营养的需求。由于VEGFR2的单克隆抗体与其发生特异性结合，阻断VEGF-VEGFR2信号通路，抑制血管异常增生，因此成为肿瘤靶向治疗的重要策略。通过基因工程开发的IgG样抗体药物结构同人体内存在的天然抗体构象非常接近，因此降低诱发免疫原性反应风险。同时，IgG样全长抗体具有高特异性、高亲和力、体内半衰期长等特性，可以发挥更大的生物活性。
MICA 属于MIC基因家族, 位于MHC-I 类区域, 具有高度多态性, 存在多种等位基因，正常情况下仅表达于上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞等表面。MICA与其相应受体NKG2D结合可传递活化信号，触发NK细胞的抗肿瘤细胞毒作用，实现对T细胞、NK细胞等参与天然免疫的相关细胞的活化，同时NKG2D也可以作为协同刺激分子增加或者协同其他活化性受体激活抗原特异性CD8 T细胞的抗肿瘤免疫作用。
本课题利用制得的抗VEGFR-2 IgG1样全长抗体(JZB00)，将JZB00的重链恒定区C末端与MICA基因通过柔性肽连接获得融合基因，获得重组载体后，将轻链和重链的重组载体两组按照一定的比例，进行交叉转染到CHO-S（cGMP-banked）细胞，筛选获得融合抗体（JZB01)，利用Dot blot和Western blot检测融合抗体的表达，同时经Protrin A柱纯化后，通过MTT比色法检测抗体活性，最终获得高亲和力、高靶向性的融合抗体。
- 研究内容
（1）JZB01的构建
对含有JZB01基因的pCA puro质粒进行PCR，扩增抗体轻重链基因，进行胶回收后，分别将其导入pMD-19T质粒，此为中间质粒，方便下一步的测序和双酶切，同时对pAS质粒双酶切，采用的酶分别为5rsquo;端NgoM IV和3rsquo;端SnaBI，将双酶切后的质粒和基因相连。
将新构建的轻链重组载体按照一定的比例进行交叉转染哺乳动物细胞，嘌呤霉素加压筛选两轮，通过Western blot检测JZB01的表达，筛选JZB01高产细胞株。
（2）JZB01的纯化及鉴定
将高产细胞株静息培养，无血清驯化，待数量足够，逐级放大到250ml和1L摇瓶中发酵培养，收集发酵液，离心去除细胞和细胞碎片以及大分子杂质，0.22um滤膜减压抽滤，根据亲和层析的原理，将滤液通过Protein A柱，即可获得较纯的抗体。采用SDS-PAGE 电泳和Western blot技术来鉴定JZB01是否正确表达，以鉴定JZB01纯度。
（3）JZB01体外与抗原结合相关活性和功能分析
