开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
1立题依据
据世界卫生组织统计，全球每年约有超过1700万人死于心脑血管疾病，位于疾病致死原因的第一位，而血栓是动脉粥样硬化、冠心病和脑卒中等多种心脑血管疾病的主要病因或并发症之一［1］。随着近几十年的发展，已经出现了多种药效良好并且应用广泛的抗血栓药物，包括抗血小板药物和抗凝药物2种，这些药物在临床上可以减少患者血栓事件的发生，但也会随之增加患者的出血风险[2]。通过文献调查发现，外源性凝血途径是参与生理性止血的主要途径，而内源性凝血途径的激活则被认为是导致栓塞性栓子形成的重要途径，对生理性止血功能不大[3-4]。有实验通过反义寡核苷酸(ASO)选择性敲除小鼠FⅫ基因，减少了动脉和静脉血栓形成，对止血无明显影响[5]。FⅫ基因缺陷会使内源性凝血途径的纤维蛋白无法生成，这抑制了血栓增加，保护血管免受闭塞性血栓形成所带来的损害[6-7]。其它动物实验结果也表明抑制内源性凝血途径的关键酶FⅫ，可有效抑制血栓形成而不增加实验动物的出血风险[8]。
凝血因子FⅫ活化后可以激活促进凝血和炎症反应的接触系统。FⅫ依赖的接触系统实际上是一个蛋白酶与蛋白酶抑制剂相互作用的网络，包含四条通路：①补体系统；②凝血级联系统；③纤溶系统；④激肽系统[9]。FⅫ在血浆中以一种浓度为40mu;g/mL(375 nmol/L)的酶原形式存在，当FⅫ与阴离子接触时会使FⅫ酶原构象发生变化，这种构象变化会诱导自身活化，变成具有活性的FⅫa。FⅫa通过启动一系列下游反应，介导凝血反应和炎症反应之间的相互作用[10]。FⅫa能激活两种丝氨酸蛋白酶--凝血因子Ⅺ(FⅪ)和血浆前激肽释放酶(plasma pre-kallikrein，PPK)，前者通过激活内源性凝血途径而促凝，后者刺激激肽释放酶-激肽系统释放缓激肽(bradykinin，BK)来促进炎症反应[11]。由此可见FⅫ在体内血栓形成中扮演着重要的角色。因此以FⅫ为抗栓研究的新靶点，开发有效、专一性强的抗凝药物是一项很有前景的研究。
近几年，一种完全人源化的重组抗体3F7与FⅫa的酶囊特异性结合，并干扰FⅫa活性和人血浆中FⅫa介导的凝血反应。抗FⅫ抗体也阻断了在小鼠模型中引发的动脉血栓形成。此外，3F7在兔体外膜肺氧合(ECMO)模型中提供了保护作用。3F7在ECMO模型的保护作用与肝素一样，但与肝素不同的是，3F7的治疗并没有影响止血功能，也没有导致出血增加。但3F7需要以高剂量（7mg/kg）给药才能达到预期结果[12]，由于重组抗体的生产成本较高，因此应用受限，一些其它的FⅫ抑制剂被研发生产出来,如小分子抑制剂、合成肽、核酸适配体和Kazal型蛋白酶抑制剂等。
Kazal型蛋白酶抑制剂是存在动物体内的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶抑制剂，Infestin-4是Kazal型蛋白酶抑制剂中的一个结构域，对FⅫa具有最高的抑制活性[13]。Infestin-4被融合到人类白蛋白，以提高其生物利用度。在小鼠中，rHA-infestin-4降低了机械诱导的动脉和FeCl3诱导的静脉血栓形成模型的闭塞率。rHA-infestin-4还保护家兔免受FeCl3诱导的动脉血栓形成和瘀阻促进的静脉血栓形成。此外，rHA-infestin-4预防了小鼠和兔动静脉分流模型中的闭塞，其中血栓形成是通过外表面诱导的。与肝素相比，兔的止血能力不受rHA-infestin-4的影响。研究数据表明，FⅫ抑制剂rHA-infestin-4在不影响生理止血的情况下降低了动脉、静脉和外表面诱导的血栓形成。因此，提供了进一步的证据，靶向FⅫa是一种有效且安全的抗血栓治疗方法，特别是在外表面触发的血栓形成中[14]。然而，体内高浓度的Infestin4会对FXa产生脱靶效应，这就造成了这种分子应用的局限性，需要得到进一步改善。
在前期的研究中，通过对比分析五步蛇毒腺转录组数据库，查阅大量文献，在转录组数据库注释文件中搜索关键词，找出高相似性序列并进行重组表达和活性测定，我们发现了具Kazal型结构的蛋白，有研究表明具Kazal型蛋白具有抑制FXⅡa的活性，我们推测这些动物来源的Kazal型蛋白也能有效抑制FXⅡa，成为有潜力的抗血栓药物。因此我们拟对这些蛋白进行克隆表达，理化性质等方面的研究。
目前有研究报道了beta;FXⅡa在大肠杆菌中的表达和纯化，但是该蛋白的纯化过程复杂并以包涵体的形式存在[15]，对获得大量的蛋白有所限制。毕赤酵母是常用的商业酵母表达系统之一，与原核系统相比，酵母作为一种单细胞真核生物，除了具有原核表达系统操作简单、培养成本低之外，酵母系统是一类以甲醇为唯一碳源和能量来源的酵母菌，它具有以下特点：蛋白翻译后的修饰加工作用；能将外源蛋白分泌到胞外培养基中，从而简化了目的蛋白的纯化工艺；蛋白比较稳定且表达量高，对营养需求低，很适合高密度发酵。为此，本实验拟采用毕赤酵母表达系统实现凝血因子XⅡ的克隆表达。
2 研究内容
本实验是建立在利用转录组数据库进行抗血栓活性蛋白的发掘，并对这些蛋白进行克隆表达以及体外活性等方面的研究，以找到活性高、专属性强的蛋白抑制剂。
