开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
课题来源：自然科学基金与部、省、市级以上科研课题
题目简介： 脑胶质瘤干细胞(GSCs)作为脑胶质瘤的种子细胞，是脑胶质瘤耐药以及复发的根源。Wnt信号通路是调控肿瘤干细胞自我更新和分化的关键信号途径，该通路的激活与肿瘤细胞耐药密切相关。前期研究工作发现体外培养的 GSCs 对顺铂、阿霉素等多种化疗药物耐药，且在这些 GSCs中Wnt信号通路异常激活，提示我们Wnt信号通路很可能在 GSCs耐药中起关键调控作用。因此研究 Wnt 信号通路调控 GSCs 耐药的作用机制，将为逆转肿瘤细胞耐药提供新的思路。关于 Wnt 信号通路调控 GSCs 耐药机制研究国内外未见报道。本课题旨在优化体外分离培养GSCs技术基础上，研究Wnt 信号通路对GSCs耐药基因及蛋白的调控机制；建立脑胶质瘤耐药细胞模型，确认抑制该通路能够提高GSCs对化疗药物的敏感性。
立题依据：
恶性肿瘤是人类死亡的主要疾病之一，而造成恶性肿瘤难以治愈的主要原因就是肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药( Multidrug resistance, MDR)。脑胶质细胞瘤是颅内发病率最高的恶性肿瘤，约占原发性脑肿瘤的40%-50%，呈浸润性生长，治疗效果差，复发率高。目前，胶质瘤综合治疗中化疗仍是重要一环，而有相当一部分胶质瘤对化疗药物耐药，严重影响了化疗效果。脑胶质瘤干细胞 (Glioblastoma stem cells, GSCs) 的成功分离与研究，证实肿瘤组织中存在少数干细胞性质的GSCs，作为脑胶质瘤的种子细胞具有自我更新，多向分化、耐药、DNA 修复活性和抗凋亡等特征，是恶性程度不同的各类脑胶质瘤耐药以及不断复发的根源。因此，以肿瘤干细胞作为切入点，深入研究GSCs的生物学特性，阐明GSCs多药耐药机制，寻找有效的逆转耐药途径，将为临床治疗脑胶质瘤提供理论依据。 GSCs很可能来源于体内正常的成体干细胞或者祖细胞，与它们有着相似的生物学特性，体外培养能够形成神经球样干细胞克隆，表达CD133, Nestin, Sox-2 和Musashi-1等干细胞分子标志，GSCs的自我更新和增殖过程受到Notch、Bim-1、Wnt等信号通路的调控；体外将GSCs接种至免疫缺陷动物体内能够致瘤，形成的肿瘤与GSCs来源肿瘤表型一致。近期研究发现恶性胶质瘤组织分离出来的GSCs表现出对替莫唑胺、卡铂、VP-16 和紫杉醇等多种化疗药物耐药。然而GSCs耐药相关研究报道较少，已知的可能机制包括：恶性胶质瘤CD133 细胞群中抗凋亡相关基因bcl-2、bcl-XL、COX2、PTEN表达水平高于CD133-细胞群，而Caspase-8的基因及蛋白水平均明显低于其他肿瘤细胞，且Caspase-8启动子过度甲基化，使得GSCs对肿瘤坏死因子相关配体TRAIL不敏感。ABCG2作为ABC转运蛋白家族成员能够利用ATP 分解产生的能量主动将细胞内的药物泵出降低细胞内药物浓度, 从而保护自身免受细胞毒性药物的损伤，其功能被认为与肿瘤细胞SP(Side populations cells)的多药抗性有关。在神经胶质瘤干细胞中证实有ABCG2 表达且其表达水平与神经胶质瘤的病理分级呈正相关, 研究还发现ABCG2 在神经胶质瘤对米托蒽醌等化疗药物产生耐药中起关键作用。U87脑胶质瘤细胞系分离出CD133 细胞群中多药耐药基因MDR1表达水平高于非干细胞群，表现出对常规化疗药物阿霉素、依托泊苷、卡铂明显耐药性。由此可见，目前GSCs耐药机制的研究主要集中在单一基因或蛋白，而调节这些耐药基因或蛋白的信号途径并不清楚。因此，积极探究GSCs中调控耐药基因或蛋白的信号调控途径，寻找逆转GSCs耐药的关键信号分子，是解决脑胶质瘤细胞耐药的关键。
在前期工作中，我们课题组已成功的从原代胶质瘤组织及神经胶质瘤细胞系中分离培养得到GSCs。同时应用免疫荧光，流式分选，软琼脂克隆等方法对这些细胞的干细胞特性进行了研究，发现体外无血清条件培养U251脑胶质瘤细胞中含有约17%的CD133 脑胶质瘤干细胞，且U251来源的GSCs高表达CTNNB1、Gli1、Bmi1、ABCG2、Notch2、 PTEN等基因；经化疗药物顺铂、卡莫司汀、鱼藤酮、Parthenolide、藤黄酸IC50剂量24h作用后，U251中CD133 细胞比例明显升高。随后应用基因组学和蛋白组学的方法对神经胶质瘤干细胞和普通神经胶质瘤细胞间差异表达的基因和蛋白进行了分析。结果表明在GSCs中Wnt通路有明显激活，Wnt通路信号分子及目的基因如Wnt7alpha;、Cyclin D1、SOX2、SOX9、MMP2等表达显著升高，此外与肿瘤细胞耐药相关诱导凋亡基因TIMP1也表达升高。这些结果提示我们Wnt信号通路很可能在脑胶质瘤干细胞自我更新及耐药中发挥重要作用。
Wnt信号通路在调控细胞增殖再生、分化、迁移、产生极性等方面起着非常重要的作用。Wnt蛋白是一类分泌型糖蛋白，至少有19种。根据是否有beta;连环蛋白（beta;-catenin）参与，Wnt信号通路分为经典途径和非经典途径。不同的Wnt蛋白与膜上Frizzled（ Fzd）家族受体结合，激活不同的下游信号途径，调控细胞的增殖、分化或迁移。
研究表明，Wnt信号途径的异常激活与脑胶质瘤的发生及其恶性程度密切相关。有文献报道Wnt5alpha;表达水平与脑胶质瘤WHO病理分级呈现正相关，下调Wnt5alpha;能够抑制脑胶质瘤细胞侵袭转移；Wnt特异性分泌蛋白Evi在恶性脑胶质瘤中高表达，沉默Evi/WIs的表达能够抑制脑胶质瘤细胞迁移和体内移植瘤的生长；FoxM1与beta;-catenin结合调控Wnt下游基因转录促进脑胶质瘤的发生；Dvl2在脑胶质瘤中高表达，沉默该基因能够抑制脑胶质瘤细胞增殖，促进分化。除此之外，Wnt信号通路在肿瘤干细胞的自我更新和增殖分化过程也起着重要调控作用。Frizzled4在高侵袭性脑胶质瘤干细胞中高表达，能够促进上皮间质转化因子SNAIL的表达，参与调控脑胶质瘤干细胞干性的维持及侵袭转移；PLAGL2调控Wnt信号通路抑制神经干细胞和脑胶质瘤细胞分化；在急性髓系白血病(AML)中，beta;-catenin的高表达与不良预后呈正相关，同时Wnt3alpha;能够促进白血病干细胞或祖细胞的数量增多。Wnt/beta;-catenin 通路激活可以导致EpCAM ( ) AFP ( )肝肿瘤干细胞数量增加。在Wnt转基因乳腺癌小鼠的乳腺癌组织中，Wnt过表达可使乳腺干细胞自我更新能力异常。在CD133 的结肠癌干细胞中beta;-catenin高表达的细胞明显较低表达细胞具有更强的致瘤性。由此可见，Wnt信号通路的异常激活是脑胶质瘤干细胞干性以及高侵袭性维持的关键。
Wnt信号通路不仅参与调控肿瘤干细胞的自我更新和分化的过程，还发现该通路的异常激活与肿瘤细胞耐药密切相关。化疗药物5-FU能够激活Wnt/beta;-catenin信号通路，使得结肠癌干细胞产生耐药，并且使用Wnt信号通路抑制剂DKK1能够提高结肠癌干细胞对5-FU的敏感性。Wnt/beta;-catenin信号通路在MLL白血病干细胞中处于活化状态，抑制beta;-catenin的活性能够提高MLL白血病干细胞对GSK3抑制剂的敏感性。阿霉素耐药的胶质瘤细胞中耐药基因MDR1高表达与Wnt受体FZD1的上调相关，给予相应shRNA沉默FZD1能够提高胶质瘤细胞对阿霉素的敏感性。TRAIL通过caspases-3/ 8介导作用引起肿瘤细胞凋亡过程中beta;-catenin优先降解是必要条件，siRNA下调beta;-catenin的表达水平能明显改善TRAIL引起的肿瘤细胞耐药。Wnt/beta;-catenin 特异性阻断剂ICG-001能够阻断beta;-catenin和转录因子辅助蛋白 CBP结合，促使白血病干细胞分化，抑制其增殖从而逆转白血病干细胞引起的耐药。由此，我们猜测脑胶质瘤干细胞内Wnt信号通路的异常激活可能是引起GSCs内耐药基因MDR1、ABCG2、MGMT表达上调，以及凋亡相关蛋白下调的关键。那么我们是否可以通过抑制该通路中关键信号分子的活性如Fzd受体功能、beta;-catenin/TCF/CBP核内转录活性来实现对Wnt下游目标基因c-myc、cyclin D1、COX2的调控，改变细胞内耐药相关基因，甚至凋亡相关蛋白的表达水平，从而逆转脑胶质瘤干细胞对化疗药物产生的耐药。
综上所述，根据本课题组前期工作基础，结合大量文献调研。我们提出以下假说即：Wnt 信号通路参与调控GSCs的自我更新、增殖状态。Wnt信号通路的异常活化使得GSCs内耐药基因MGMT、ABCG2、MDR1以及凋亡相关蛋白的表达发生改变，引发GSCs产生耐药；可以通过抑制Wnt信号通路的活性削弱GSCs的干性，抑制GSCs增殖，下调耐药基因及凋亡蛋白的表达，实现逆转GSCs多药耐药，提高化疗药物的治疗效果。
