基于两亲性树型分子的DNA递送系统的构建与理化性质的表征
开题报告
- 课题来源及选题依据
基因治疗是将外源遗传物质，如DNA、mRNA、小干扰RNA（siRNA）、微RNA（miRNA）或反义寡核苷酸，转移到患者的特定细胞，以增强基因表达或抑制某种蛋白的产生[1]。基因治疗与传统治疗方法相比，具有无可争议的优越性。它从根源上修正了引起疾病的异常基因，可以选择性地治疗多种严重威胁人类健康的疾病，包括遗传病、恶性肿瘤和心血管疾病等。目前，基因治疗已经成为医学领域里一个新的研究热点。
本课题使用的是质粒DNA（pDNA）。pDNA是存在于细菌染色体外的一个或多个能独立复制并稳定遗传的小型环状双链DNA 分子，其分子量一般在0. 2 ～ 10kD 范围内。由于pDNA分子小，便于分离和提取，可以携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达。基因转染实验中常将经改造后的质粒作为运送基因的载体。将治疗基因连接在表达的质粒载体中进行DNA 注射而不依赖其他物质( 脂类或蛋白质) 介导，是最简单的载体系统。1990 年，Wolf [2]等人在没有借助任何递送系统的情况下用质粒直接肌肉注射小鼠，并得到了表达。pDNA提取效率及质量对后续实验步骤的成功与否有着直接的关系，因而高效快速地从细菌细胞中分离纯化质粒具有重要意义[3]3。生产pDNA一般的工艺流程为：工程菌发酵培养→裂解细胞→固液分离→澄清与浓缩→分离纯化→质粒DNA浓缩[4]。首先用LB固体培养基对工程菌进行发酵培养，然后根据《分子克隆指南》中用十二烷基硫酸钠（SDS）碱裂解法提取pDNA粗品，再用离心法进行固液分离，并使用异丙醇沉淀，之后用70%的乙醇对提取液进行澄清与浓缩。粗提取的pDNA纯度较差，因此本实验将用DEAE52-Cellulose树脂对粗制品进行阴离子柱层析纯化。最后在进行pDNA的浓缩。
基因治疗的目的是将基因治疗药物运送到特定的靶细胞，而裸露的基因治疗药物存在以下缺点：a．在组织或细胞中易被核酶降解；b．细胞靶向能力差； c．自身所带的负电荷与细胞膜之间存在排斥作用，导致其细胞内吞和内涵体逃逸能力差[5]。以上缺点造成基因治疗效果不佳。因此，需要寻求合适的载体负载基因治疗药物。
基因递送载体可分为病毒载体和非病毒载体。 在已有的基因治疗病例中,80%的研宄都是釆用病毒载体。虽然病毒载体具有高转染性，但是，由于其自身的免疫原性、潜在的危险性、对靶基因大小的限制性以及操作工艺的复杂性等原因,限制了它在临床试验中的进一步应用和发展。而非病毒载体能解决许多上述限制，但是由于转染效率递过低、细胞毒性大、且未能克服递送过程中的多种障碍而鲜少应用于临床[6]。
本课题应用实验室自主合成的富含赖氨酸的两亲性树状脂肽DSPE-G2作为pDNA的递送材料。DSPE-G2的二代赖氨酸结构模拟病毒的高生物活性分子——细胞穿透肽（CPPs），能显著提高细胞穿透与基因递送[7]7；DSPE-G2自组装形成硬脂酰C18疏水尾向内，二代赖氨酸亲水头向外的仿病毒结构载体[8]8。由DSPE-G2构成的病毒启发型纳米载体，整合了病毒、非病毒载体的优点，将成为新一代的基因递送载体[9]9。
基因转染是个复杂的过程。包括：1）阳离子基因载体与负电性核酸通过静电作用形成稳定的纳米级复合物；2）复合物通过胞吞作用进入靶细胞内，存在于内涵体-溶酶体系统中；3）实现溶酶体逃逸进入细胞质中；4）pDNA与载体解离，进入细胞核转录翻译，最终实现基因转染[10]。聚合物载体PEI能与DNA形成稳定的复合物，具有较强的细胞摄取、溶酶体逃逸功能而成为体外转染的金标准，但是其主要的缺点是细胞毒性大，会造成严重的细胞凋亡，且难以与pDNA解离[11]。本课题使用的DSPE-G2具有大量类似于PEI的可质子化的胺基氮原子，所以具有类似于PEI的溶酶体逃逸能力。根据Xianghui Xu [12]11等人采用AVNs作为基因载体的实验发现，AVNs与pDNA在细胞质中的解离能力优于PEI，因而预期本课题中使用的DSPE-G2能实现与PEI相当甚至高于PEI的转染效率。另外上述实验结果中还指出，富含精氨酸的AVNs/DNA的N/P比值在一个较宽的范围内，细胞毒性相对较小，基本不会导致细胞凋亡，且精氨酸修饰的载体有利于提高细胞摄取率，因此预计富含赖氨酸的两亲性树状脂肽DSPE-G2能达到类似的效果。
参考文献
