一、课题背景
动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）是心脑血管疾病的主要病理基础，表现为大动脉及中动脉的血管内壁出现脂质沉积，形成分散或成片的粥样斑块，造成动脉管腔狭窄，若斑块破裂出血，则在狭窄的动脉内形成血栓，具有缺血性脑卒中和心肌梗死的风险[1]。引起动脉粥样硬化的危险因素有很多，其中以脂质代谢紊乱最为重要，高胆固醇血症患者患动脉粥样硬化风险大大升高。在斑块内，脂质堆积和氧化应激的炎症微环境具有招募循环中单核细胞的作用，趋化的单核细胞在动脉组织中转化为巨噬细胞。而这些巨噬细胞表面大量表达修饰的低密度脂蛋白受体，如CD36受体、清道夫受体A1（SR-A1）、清道夫受体B1（SR-B1）、低密度脂蛋白相关受体蛋白1（LRP-1）等[2]。不断吞噬低密度脂蛋白的巨噬细胞逐渐泡沫化，形成脂质富集的泡沫细胞，越来越多的泡沫细胞和脂质形成了斑块的坏死核心，进而斑块变得易损。
高密度脂蛋白（HDL）是血浆脂蛋白的一种，主要有磷脂和载脂蛋白组成，具有盘状和球状两种形态。HDL不仅具有将外周细胞组织中的胆固醇转运回肝脏进行代谢的作用（胆固醇逆转运），还具有抗氧化和抗炎等抑制动脉粥样硬化作用。Apo AI是高密度脂蛋白的主要蛋白质成分，约占其蛋白质含量的70% [3]，也是高密度脂蛋白发挥抗AS功能的最主要成分，其能够靶向巨噬泡沫细胞中的特定受体如SRBI和ABCG1[4]，并介导多余的胆固醇流出，从而减少脂质蓄积，发挥血管保护作用。在介导细胞内流出的胆固醇时，盘状HDL接受胆固醇，其上的卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）将胆固醇酯化并进入HDL核心，促使盘状HDL向球状HDL转化并将胆固醇转移至肝细胞并排出，完成胆固醇的逆向转运[5]。故高密度脂蛋白对于缓解动脉粥样硬化，延缓脂质沉积具有重要作用。
从血浆提取高密度脂蛋白成本高且工艺复杂，而在体外利用磷脂和载脂蛋白重建的重组高密度脂蛋白（rHDL）具有与内源高密度脂蛋白相似的长循环半衰期、优异的生物相容性和SR-BI特异性靶向性。因此，利用重组高密度脂蛋白纳米颗粒(rHDL)递送抗动脉粥样硬化药物靶向斑块部位具有非常大的潜力。近年来，由apo AI或其模拟肽和磷脂构建的重组高密度脂蛋白颗粒（rHDL）已被众多课题组研究制备，并发现其能模拟和血浆高密度脂蛋白几乎相同的生物学功能[6,7,8,9]。重组高密度脂蛋白颗粒虽然是一种人工制备的纳米药物载体，但它含有与高密度脂蛋白相似的成分[10]。目前，临床常用他汀类降脂药物如阿托伐他汀，辛伐他汀等调节血脂水平，延缓动脉粥样硬化，但药物起效慢，口服治疗剂量的他汀类药物难以达到抑制斑块的作用，对动脉粥样硬化的治疗效果不是很理想[11]。故我们尝试制备载辛伐他汀的重组高密度脂蛋白，并体外构建泡沫细胞模型，考察其介导胆固醇流出的能力，以及细胞毒性和细胞水平药效学研究。
- 研究概况
现有研究发现：在较小的高密度脂蛋白中，载脂蛋白AI的螺旋结构域更多地展开，从而增加与膜脂的相互作用，以促进载脂蛋白AI介导的胆固醇流出[12]；并且，尺寸较小的高密度脂蛋白更容易穿过细胞周围不流动的水层，增强细胞膜中游离胆固醇的快速碰撞和吸附[13]；小的高密度脂蛋白颗粒可以更容易得渗透到动脉壁下的间隙中，介导大部分游离胆固醇从泡沫细胞中流出，从而潜在地降低脂质沉积水平[14]。通过构建不同性状和大小的空白rHDLs库，Tang等[15]已经说明了胆固醇流出能力主要与颗粒大小有关。因此，我们推测具有仿生大小的盘状r-HDLs可能更有效的介导胆固醇的流出。
辛伐他汀（ST）为他汀类药物,是临床上治疗高脂血症的一线用药。ST作为羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG-CoA）抑制剂,主要通过抑制机体内源性胆固醇的合成以及血液中胆固醇的含量来起到降血脂，缓解动脉粥样硬化的作用。但是ST溶解度较差，口服生物利用度有限,因此其临床应用受到一定限制[16]。而以r-HDLs作为载体递送辛伐他汀，不仅可以提高口服生物利用度，同时具有优良的生物相容性,较高的载药量,生物可降解等优势,极具发展前景和应用前景。
- 研究目的
关于载药的r-HDLs的颗粒大小是否会影响胆固醇流出能力这一问题尚不清楚，因此，本实验通过制备不同粒径大小的在载辛伐他汀的重组高密度脂蛋白，并构建细胞模型，来考察其细胞毒性，细胞摄取能力以及其介导胆固醇流出能力的差异，从而筛选出最佳尺寸的载药高密度脂蛋白纳米系统。
- 研究方法和内容
- 不同粒径大小的载辛伐他汀 d-rHDLs 的制备与表征
用乙醇注入法，制备不同粒径大小得载辛伐他汀盘状重组高密度脂蛋白。前期已通过优化处方，构建出了三种不同粒径大小的空白d-rHDLs，本实验将辛伐他汀作为模型药物加载到空白d-rHDLs中，从而得到不同粒径大小的载辛伐他汀盘状重组高密度脂蛋白（ST-d-rHDLs）。
- 细胞安全性实验和摄取机制研究
2.1细胞毒性考察
培养小鼠巨噬细胞株RAW 264.7细胞，用MTT法检测三种不同粒径大小的ST-d-rHDLs的细胞毒性。
