CRISPR/Cas9系统的发展完全颠覆了人们编辑DNA序列和调控目标基因表达水平的能力,从而为生物体的精确基因组编辑提供了有力的工具。人们将CRISPR/Cas9系统进行精简使其分为两部分:Cas9蛋白和sgRNA。其作用原理为：sgRNA自身具有Cas9蛋白的结合位点可以与Cas9蛋白形成Cas9-sgRNA复合物。而且Cas9-sgRNA复合体中的sgRNA部分含有可以与与目标基因按照碱基互补配对原则进互补配对的碱基区序列。配对成功后，Cas9利用自身的核酸内切酶活性对目标DNA序列进行剪切。相较于与传统的基因编辑技术，CRISPR/Cas9系统具有明显的一些优势:易用性、简便性、低成本、可编程性以及可同时编辑多个基因。现在该基因组编辑技术以已经不单单应用于真核和原核生物中，而且还在植物例如水稻、小麦，动物当中广泛的应用。1987年有学者研究推断出结论：细菌中的CRISPR/Cas9系统是抵抗病毒入侵的一种免疫机制[1]。CRISPR系统有I、Ⅱ、Ⅲ3种类型。 I型和Ⅲ型需要多种Cas蛋白和crRNA共同发挥作用。而II型仅需要crRNA 、tracrRNA和Cas9相互协作即可降解外源DNA。总的来说,II型相对于I型和III型要求较低。因此，在这三种类型当中II型是被研究的最透彻的一种，应用也是最广泛[2]。
CRISPR/Cas9的II类结构系统在细菌中的作用原理:当外源性核酸入侵细胞时，受体细胞将自动合成一个新的间隔序列，插入到CRISPR位点的第一个重复序列前。这个时候，细胞中的Cas蛋白会结合在外源性的核酸上并将其剪切成许多大小不同的片段。之后受体细胞中的某些机制会识别这些片段，寻找含有PAM的片段。找到之后,PAM及PAM前20bp的序列将被复制，作为一个新的重复序列整合到新间隔序列的上游。若相同的病毒又在此入侵细胞，CRISPR/Cas9 系统开始转录形成pre-erRNA,同时,转录反式激活crRNA.即与重复序列互补的tracrRNA。Cas9可以对pre-crRNA进行加工使其转化为较短的保守成熟crRNA,再与tracrNA及Cas基因转录的蛋白结合成为复合体。复合体先解开一小段人侵DNA的双链，并识别其序列，若不能与该序列成功配对，则再向前前进继续解开一小段DNA，后面一小段重新聚合，令入侵的的双链始终保持一定长度，复合体在解链区域沿双链打开的方向依次识别,循序渐进。直到重复序列可以与入侵的DNA序列成功配对时，Cas9蛋白可以发挥核酸内切酶作用然后剪切互补链，导致入侵的DNA无法正常表达。
根据细菌抵抗外源性DNA的原理，构建了CRISPR/Cas9系统的空载体。只需要将目的片段接入载体然后通过转化整合到受体基因组中发挥作用。通常的操作是用几个碱基把crRNA和tracrRNA连接起来，形成发卡结构，称之为SgRNA。该SgRNA-Cas9系统可以将含有目的基因的载体转入整合到小鼠、斑马鱼、果蝇、拟南芥、烟草、水稻等物种基因组上[3-7]。
常见的基因打靶载体包括有3种类型：第一种是含有2个最终打靶载体，其中一个含有Cas9，行使切割功能，另外一个含有目的基因序列,行使识别功能。只有当2个载体均发挥其功能时，才能识别靶标基因并打靶成功。第二种是一个最终打靶载体,一个载体当中不但含有行使切割功能的Cas9原件，还具有识别目的基因序列的原件。而且识别目的基因的打靶时类似于单酶切，能导致某一处DNA双链发生断裂。第三种和第二种类似，也是并个最终打靶载体，但识别目的基因序列的原件包含2个启动子。
Broad Institute的Feng Zhang 、HarvardMedical School的George Church，以及Seoul National University的Jin-Soo Kim他们都用各自的方法来仔细的研究CRISPR/Cas系统——即化脓性链球菌的Cas9核酸酶以及两种非编码性RNA，也就是当CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（trans-activatingcrRNA, tracrRNA一起的时候，可以对哺乳动物细胞内源性基因序列产生的切割的作用[8]。
在tracrRNA和crRNA共同进入细胞内后，先是crRNA特异性地识别配对靶基因序列，也就是crRNA上的20个碱基与目的基因进行互补配对。前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif, PAM）以NGG形式存在，且就排列在20个碱基对长度的靶序列后。crRNA的识别作用中PAM起着至关重要的作用，现在人们已将两种RNA合为一个，即整合成guide RNA(gRNA) [9]。
锌指核酸酶（zinc-finger nucleases, ZEN）与转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activator–likeeffector nucleases, TALEN）是现在常用的基因组DNA编辑工具[10]。CRISPR-Cas系统相比与上述的两种DNA编辑系统，它只需要将靶向的DNA序列克隆至gRNA载体中。然而TALEN必须要即耗费财力又耗费精力的模块的组装。已有研究表明CRISPR-Cas系统对哺乳动物基因的切割效率与TALEN的切割效率相当，甚至更高。Church与Zhang均报道用CRISPR/Cas系统切割靶基因位点，非同源末端连接修复（nonhomologous end joining–basedrepair）和将供体的基因序列转导入细胞中同源重组（homologous recombination）的机制所引起的遗传突变[11-12]。Kim的研究团队采用有限稀释法（limiting dilution），而并未使用抗生素选择法（antibiotic selection），从而获得了突变型克隆细胞系，这些研究表明细胞对该系统的耐受性非常好。
同样来自于哈佛大学医学院的Keith Joung等人组成的研究团队应用RNA引导性基因编辑（RNA-guided editing）技术，使斑马鱼的内源性基因产生突变，从而使80%以上的靶位点出现突变。尽管他们报道称该方法不会对胚胎产生显著的毒性效应，但是成鱼是否会出现不利表型，遗传变异是否能传递给下一代，这仍有待观察。[13-14]
RNA引导性核酸酶（RNA-guided nuclease, RGEN）会不会对真核细胞的基因序列进行不加选择的切割，RGEN有多大的可能性会在靶外位点上进行切割[15]。美国洛克菲勒大学（Rockefeller University）的Marraffini等人利用CRISPR系统，对重组型肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的基因组进行了RNA引导性基因编辑，同时他们结合CRISPR系统与基因重组工程技术，对大肠埃希氏菌（Escherichia coli）的基因组也进行了RNA引导性基因编辑。他们发现在靶序列上，如果PAM附近的12个核苷酸内出现单个核苷酸的改变的话，就会停止切割作用，但是每种单核苷酸改变对切割作用的影响程度并不一样。PAM序列是切割过程中至关重要的要素，但是机体还能够耐受PAM上的某些单核苷酸变异，即便这些单核苷酸变异会降低切割效率[16-17]。
参考文献：
