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垂体前叶等生化药品原材料中猪、牛、羊源性成分 PCR检测方法的建立 一、 研究背景 生化药品是指从动物的器官、组织、体液、分泌物中经前处理、提取、分离、纯化等制得的安全、有效、质量可控的药品。主要包括：蛋白质、多肽、氨基酸及其衍生物、多糖、核苷酸及其衍生物、脂、酶及辅酶等。生化药物源自生物体，其来源复杂、组成不明确，单靠质量标准无法有效地控制产品的质量，必须在原料的来源和加工工艺处就建立相应的检验步骤，才能更好的控制终产品的质量，保证临床应用的安全和有效。 2015版中国药典在凡例中规定来源于动物组织提取的药品，其所用动物种属要明确。不同动物、不同组织来源的药品其药效可能存在一定差异，所产生的不良反应也可能不同。例如，有报道显示，牛源性肝素引起人血小板减少的不良反应是猪源性肝素的2倍。另外，明确原料药种属来源对防止疯牛病、羊瘙痒病等疾病的传播，有极为重要的意义。由于制药所用动物组织或脏器大多直接来源于屠宰场，所以不同来源的动物材料存在互相污染的可能性。因此，建立一套鉴别原料种属来源的简单快速的方法对生化药品的质量控制有深远的意义。 二、 研究目标 目前，在食品、饲料行业，采用分子生物学技术对动物源性的鉴别比较常见，但在药品检测方面应用较少。现在已有的种属鉴别方法有形态学分类方法、细胞学鉴定方法、生物化学鉴定方法、免疫学鉴定方法以及分子生物学方法等。分子生物学中的聚合酶链式反应（（Polymerase Chain Reaction，PCR））方法具有特异性强、灵敏度高、简便快捷等优点，加之核酸作为遗传物质具有结构相对稳定、能够自我复制、能够储存遗传信息的优良特性，PCR方法近年来被广泛使用。 本课题旨在结合常规PCR方法和TaqMan探针实时荧光定量PCR技术来鉴别垂体前叶样品等生化药品原材料的动物源性，并对所建立的方法的特异性、灵敏度及耐用性进行相关方法验证。从而给药品生产企业及药品检验部门提供一套简便快捷且合理有效的种属鉴别方法，希望对提高生化药品的质量及安全性提供一些参考依据。 三、 研究方法 1.常规PCR反应 PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，模板DNA双链解离成为单链，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合，DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。如此循环往复，便可在短时间内达到使目的基因大量扩增的目的。 2. TaqMan探针实时荧光定量PCR技术 将标有荧光素的TaqMan探针与模板DNA混合后，完成高温变性、低温复性、适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链式反应规律，与模板DNA互补。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。PCR扩增时，Taq酶5-3外切酶活性将探针酶切降解，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化的荧光强度，并根据达到特定荧光强度所需的循环数（即Ct值）对模板中是否存在待检测的动物源性成分进行判定。 四、 研究内容 1. 垂体前叶样品动物源性的鉴别 垂体，位于丘脑下部的腹侧，是身体内最复杂的内分泌腺。垂体可分为腺垂体和神经垂体两大部分，其中，腺垂体为垂体前叶，神经垂体为垂体后叶。垂体前叶主要分泌6种激素，分别为生长激素、促肾上腺皮质激素、促甲状腺激素、促黄体生成素、促卵泡刺激素及催乳素。下丘脑或垂体的各种病变可累及垂体的内分泌功能，引起内分泌腺功能减退，临床上称为垂体前叶功能减退症。 目前，临床上以垂体前叶为原料提取制成的药品主要为垂体前叶肾上腺皮质提取物注射液。该注射液为猪脑垂体前叶提取物与肾上腺皮质提取物混合制成的无菌水溶液，具有明显的抗炎、止痛、解热、恢复关节功能的作用; 且能促进核酸、蛋白质的合成，临床上用于治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎。其生产工艺主要是将猪脑垂体前叶粗粉与猪肾上腺粗粉分别溶解后，经胃蛋白酶水解，再经截留相对分子质量为10000 道尔顿的超滤柱超滤，得垂体前叶提取物与肾上腺提取物，混合后用灭菌水溶解而成。 （1） 核酸的提取。 本课题拟利用Promega磁珠法核酸提取试剂盒进行核酸提取。磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。通过细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。反应一定时间之后，再在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，回收颗粒（即磁珠-DNA 混合物），再用洗脱液洗脱即可以得到纯净的DNA。此方法简单、快速，所提取核酸浓度高，并且可以实现自动化操作。 （2） 用微量核酸测定仪测定核酸浓度及纯度。 （3） 常规PCR扩增 将从样品中提取到的核酸稀释一定倍数后，分别利用猪源性、牛源性、羊源性特异性引物进行扩增。 （4） PCR产物的酶切验证 猪源性引物的扩增产物按照Mnl Ⅰ核酸限制性内切酶的酶切反应条件操作，牛源性引物的扩增产物按照Dpn Ⅱ核酸限制性内切酶的酶切反应条件操作，羊源性引物的扩增产物按照Mbo Ⅰ核酸限制性内切酶的酶切反应条件操作。酶切结束后进行琼脂糖凝胶电泳。在凝胶成像系统观察结果。 （5） TaqMan探针实时荧光定量PCR反应 实验采用TaKaRa实时荧光PCR试剂盒。用猪源性、牛源性、羊源性引物分别扩增稀释过的样品DNA，反应结束后计算每次扩增的Ct值。通过Ct值判断样品中所含有的动物源性成分。 2. 其他生化药品原材料动物源性的鉴别 根据垂体前叶样品的实验结果，采用相似的方法对糜蛋白酶原、玻璃酸酶等样品的动物源性进行鉴别。 五、 方法验证 1.特异性验证：从猪、牛、羊的动物组织中提取DNA。通过核酸测序，与Genbank核酸数据库中的物种序列进行比对。若比对结果良好，则将上述三种DNA分别作为猪、牛、羊源性成分的阳性对照品使用。将三种不同来源的DNA分别用猪特异性引物、牛特异性引物、羊特异性引物进行扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，利用凝胶成像系统观察结果，据此对方法的特异性进行考察。 2. 常规PCR方法灵敏度验证：取猪、牛、羊阳性对照DNA，进行梯度稀释。将稀释后的DNA分别用猪源性引物、牛源性引物、羊源性引物进行扩增，扩增产物分别用Mnl Ⅰ核酸限制性内切酶、Dpn Ⅱ核酸限制性内切酶、Mbo Ⅰ核酸限制性内切酶进行酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，在凝胶成像系统中观察有特异性条带产生的泳道，进而确定该方法对猪、牛、羊三种动物源性成分的灵敏度。 3. TaqMan探针实时荧光定量PCR反应灵敏度验证：取猪、牛、羊阳性对照DNA，进行梯度稀释，将稀释后的DNA进行TaqMan探针荧光聚合酶链式反应。反应结束后计算Ct值，从而得知Ct值小于35的阳性对照核酸浓度，进而得知该方法对猪、牛、羊三种动物源性成分的灵敏度。 六、 可行性 本课题拟完成场所为上海市食品药品检验所分子生物学实验室。本实验室具有多年的分子生物学研究经历，有一定的研究基础，并有从事分子生物学研究的专业指导老师对本课题进行指导。实验室配备有96 孔热循环仪, 实时荧光 PCR仪,凝胶成像系统,电泳仪,超微量核酸测定仪，台式离心机等实验所需仪器。实验室可提供实验所需的核酸提取试剂盒、PCR反应所需引物及缓冲液，猪、牛、羊三种动物的特异性核酸内切酶以及TaqMan探针实时荧光定量PCR反应试剂盒等。实验所需各种耗材充足。实验室硬件条件、软件条件均可满足本课题研究要求，本实验方案具有可行性。 七、 参考文献 [1]金萍,结莉,陆俊,陈英,丁洪流. Taqman探针荧光聚合酶链式反应实时同步鉴定动物源性食品中猪肉、鸡肉源性成分[J]. 肉类研究,2016,(09):17-22. [2]周朝东,白海娇,黄哲甦. 肝素样品前处理方法比较及荧光定量PCR法鉴定肝素原料种属来源[J]. 中国生化药物杂志,2016,(06):197-199. [3]郭江红,曾浩,张威. 垂体前叶肾上腺皮质提取物注射液中高分子物质测定[J]. 中国药师,2015,(10):1666-1668. [4]王自强,何素婷,邵泓,陈钢. 肝素钠中猪、牛及羊源性成分的PCR检测[J]. 中国药师,2015,(09):1506-1511. [5]余燕,何素婷,王自强,邓锋. 实时荧光定量PCR和常规PCR检测肝水解肽样品中牛、猪源性成分的对比研究[J]. 中国生化药物杂志,2015,(05):18-20. [6]彭武,杨琍琦. 垂体前叶功能减退症的研究进展[J]. 医学综述,2012,(24):4150-4153. [7]何素婷,段徐华,邵泓,陈钢. 肝水解肽样品中牛源及猪源性成分的PCR检测[J]. 药物分析杂志,2012,(06):1064-1068. [8]毕宇涵,闫冰,赵凤,王明娜,韩希妍,吕琦,姜毓君. 双重PCR检测食品中的动物源性成分[J]. 食品工业科技,2009,(03):315-318. [9]任丽萍,范慧红. 我国生化药品的质量现状与展望[J]. 中国生化药物杂志,2016,(10):1-4 173. [10]林昂，浅谈生化药物生产过程中的质量控制[J]. 中国药事,2011,(08):826-828. [11] FW Janssen1,Species identification in meat by using PCR-generated satellite probes[J] Journal of Industrial Microbiology Biotechnology (1998) 21, 115120 [12] Mi-ju Kim, Species identification of commercial jerky products in food and feed[J]Food Control 78 (2017) 1-6 [13] Qing Huang,Species-specific identification of ruminant components [J]Anal Bioanal Chem (2012) 402:16251634 [14] Kyung-Young Song,Ultra-fast DNA-based multiplex convection PCR method for meat species identification with possible on-site applications[J] Food Chemistry 229 (2017) 341346 |
资料编号：[371364]
