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开题报告内容： 一、研究背景 beta;-内酰胺类抗生素（包括常用的青霉素和头孢霉素等）一直被视为治疗严重感染的中流砥柱，而碳青霉烯类抗生素由于在beta;-内酰胺类药物中抗菌谱最广、抗菌性最强，以及对普通beta;-内酰胺酶高度稳定等特点，已成为对抗超广谱beta;-内酰胺酶（Extended-spectrum beta;-lactamase，ESBL）的主要抗菌药物之一。然而，随着抗生素的广泛使用，细菌耐药性不断增加，原因之一是细菌产生的能水解beta;-内酰胺环而使抗生素失活的beta;-内酰胺酶。Amber RP报道根据beta;-内酰胺酶分子结构氨基酸的不同，在分类学上，将该酶分为A,B,C,D四类，其中B类活性中心为1～2个金属离子（通常为锌离子），且必须依赖金属离子才能发挥催化作用，所以称此类为金属beta;-内酰胺酶（metallo-beta-lactamase，MBL），其活性可被离子螯合物EDTA、菲咯啉以及巯基化合物所抑制，但不被克拉维酸、舒巴坦等常见的beta;-内酰胺酶抑制剂抑制。近年来出现的一些革兰氏阴性菌能够产生金属beta;-内酰胺酶，其最大特点是可以水解碳青霉烯类的抗生素，且活性不受克拉维酸（Clavulanic Acid）等beta;-内酰胺酶抑制剂的影响，甚至能水解一些A类beta;-内酰胺酶的抑制剂，如舒巴坦、三唑巴坦等。因此，产生金属beta;-内酰胺酶的细菌对所有beta;-内酰胺类抗生素都有一定的耐药性。 目前,实验工作者已经针对p一内酞胺酶抑制剂的抑酶机理做了很多有意义的研究'但是,其中还存在着不少争议'与实验相比,理论工作显得有点落后'创门大多只是集中在抑制剂的酞化反应上,而p一内酞胺开环以后的反应,理论研究少之又少'。基于这种研究现状,又有一些把研究重点放在了抑制剂日一内酞胺环开环后的后续反应上'.这些传统的研究中都是研究抑制剂对活性位点的抑制，但以这类抑制开发的抑制剂不能完有效的抑制某些内酰胺酶的水解活性。一种基于噬菌体展示的实验显示，单独选择的抗体链可以有效的抑制VIM-4金属内酰胺酶。通过对50中纳米抗体的筛选，只有NbVIM_38可以抑制VIM-4。通过丙氨酸扫描实验，发现他的结合部位在其脱氢氨基酸链上。通过研究发现有部分抗体酶可以对金属酶产生变构抑制，因此本实验就通过分子动力学模拟的方法来探究其变构抑制机制。以期对抑制剂的开发作出指导。 二、拟研究的问题 1.寻找NbVIM_38对VIM-4变构抑制位点 2.探寻NbVIM_38对VIM-4的变构抑制机理（其结合到VIM-4上对VIM构象的影响） 3．拟采取的研究方案 总：分子动力学方法 实验一、预实验（查文献） 在文献《BJ2013_Allosteric inhibition of VIM metallo-beta;-lactamases by a camelid nanobody》中通过噬菌体展示、丙氨酸筛选等方法已证明NB_VIM对VIM-4的结构确实是有影响的，也改变了其水解活性。本实验就是是要从计算机模拟的角度探究其变构机理 实验二：变构抑制分子模拟实验 1.通过同源建模的方法构建出Nb_VIM38，分子动力学方法优化得到合理结构 选用软件：Discovery studio 准 备：需要建模蛋白质的氨基酸序列 查询此抗体酶是否有二硫键、如果有找到其位置 步 骤：1）准备运行protocal(sequence analysis) 2) 通过BLAST Search(DS Server)Protocal 寻找同源结构 3）分析BLAST结果 4）打开选写的结构 5）使用Align Multiple Sequence Protocol进行序列比对 6）使用MODELER 建立一个3D结构 7）建模优化，评分 2.将同源建模得到的NBVIM_38与VIM-4对接找到合理的抑制位点 选用软件：discovery studio 准 备：优化后的NbVIM_38结构、VIM-4结构文件 为了使同源建模得到的NbVIM_38结构更加友好可以对其进行分子动力学 操作 步 骤：1）ZDOCK：蛋白质抑制位点预测（相互作用位点） 2）ZRANK：对ZDOCK结果重新打分（通过聚类、过滤对接构象） 3）RDOCK：优化ZDOCK的结果 3. NBVIM_38与VIM-4对接的复合物结构跑分子动力学，分析动力学前后VIM-4构象的变化 分子动力学模拟(moleculardynamics simulation, MD)是在评估和预测材料结构和性质方面模拟原子和分子的一种物质微观领域的重要模拟方法,通过计算机对原子核和电子所构成的多体体系中的微观粒子之间相互作用和运动进行模拟,在此期间把每一原子核视为在全部其他的原子核和电子所构成的经验势场的作用下按照牛顿定律进行运动,进而得到体系中粒子的运动轨迹,再按照统计物理的方法计算得出物质的结构和性质等宏观性能. 简而言之即是应用力场及根据牛顿运动力学原理所发展的一种计算机模拟方法. 4.将NbVIM_38的对接复合物与抗生素分子进行对接 选用软件：discovery studio 准 备：对接复合物、抗生素分子 步 骤：1）在drugbank数据库中下载抗生素分子 2）查阅读文献分析VIM-4的活性位点 Ligandfit 3）导入VIM-4结构并定义其活性位点 4）产生Hotspots及对接结果 5）结果分析 Chifex 使用Chifex算法产生受体侧链氨基酸构象集→计算Hotspots 计算配体 构象集→小分子构象与Hotspots匹配→修改受体侧链构象→退火、能量 最优化 实验三：变构通道（机理）的研究 CAVER是一个软件工具蛋白质结构分析和可视化。隧道都是无效的途径，导致一个的蛋白质核心，周围的溶剂埋在腔。不同于隧道，渠道通过蛋白质的结构导致的，这两者的结尾被打开以周围的溶剂。药物设计和分子酶学研究这些途径是非常重要的。 选用软件:CAVER.3.0 |
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参考文献： Jean S. SOHIER*, Clmentine LAURENT.Allosteric inhibition of VIM metallo-beta;-lactamases by a camelid nanobody[J].Biochemical Journal Immediate Publication ,2013 谭 萍, 赵玉驰.金属-内酰胺酶最佳酶抑制物的研究[J].实用预防医学,2007 沈秉正,郑珩.B型金属beta;-内酰胺酶抑制剂研究进展[J].中国新药杂志,2011 |
