开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 研究问题
分子信标（Molecular beacon）是一种荧光标记的寡核苷酸链，由Tyagi和Kramer在1996年首次建立[1]。分子信标具有灵敏度高,特异结合性好等优点，能方便地运用于核酸与蛋白质的研究，为生物大分子的功能和作用机理的研究提供了丰富的实时信息，是一种极具发展前景的新型技术。也因为这些特点，分子信标被广泛应用于生物学和生物分析领域。在注重功能基因研究的后基因组时期,分子信标将会被更多地应用于基因突变引起的疾病的研究、活细胞中RNA的检测、蛋白质的检测及生物芯片研究等。随着分子信标技术的发展和新型分子信标的不断出现,分子信标将会在基因诊断、基因治疗以及新药的研制开发等方面得到越来越广泛的应用。本实验拟通过设计合理的分子信标序列，并在实验中不断改进结构，运用 qPCR 方法实现对 HSV-1 病毒的实时定量分析。
- 研究手段
1.利用 NCBI 网站可以查询 HSV-1 的基因序列，通过 NCBI 网站的 Blast 功能进行比对找寻合适的基因片段作为分子探针设计的模板。
2.使用 NCBI 的 pick primer 功能设计实验条件下可用的引物对。
3.通过qPCR方法，控制不同变量检测荧光强度的变化，从而研究分子探针的性质及进一步改进结构。
- 研究背景及综述
分子信标是一段呈茎-环结构的人工合成的短链DNA，主要由三个部分组成：①环部分：包含15-25碱基的核酸序列，主要作用是与靶分子互补，特异性结合；②茎干部分：一般有5-8个互补碱基对的序列，该结构与杂交后环状区-靶分子的双链结构之间的热力学平衡关系，使分子信标的杂交特异性明显高于常规的线状探针；③荧光基团和猝灭基团：两种基团分别与分子信标的5rsquo;端和3rsquo;端相连接，分子信标在与靶分子作用之前，荧光基团与荧光熄灭基团之间的距离很小，因此发生荧光共振能量转移（FRET）[2]，分子信标不发出荧光。当分子信标遇到目标分子时，环状部分会自动识别并与之碱基互补配对，这种杂交使分子信标发生构象变化，发生互补配对后环状部分长于茎杆部分迫使茎杆结构分开恢复荧光。
分子信标在多领域皆有重要应用。包括①在实时定量PCR中测定靶标浓度，已有多通道分子信标荧光聚合酶链反应（MQ-PCR）实现了对新生儿IFI病原体的早期检出[3]；②多个靶核苷酸的同时检测，常用多色分子信标和波长转移分子信标来实现检测多个靶核苷酸的目的[4]；③体外 DNA 和 RNA 检测，可以作为“分子断裂灯”来检测和研究DNA 裂解以及 DNA 片段的连接或核酸接合作用[5]；④用于核酸酶的研究，由于限制性核酸内切酶具有 5rsquo;到 3rsquo;端外切酶活性，因此限制性核酸内切酶可以将完整的分子信标切割成片段，使分子信标失去完整的茎-环结构，荧光基团和淬灭基团分开，从而使分子信标产生荧光；⑤研究 DNA-蛋白质的相互作用、蛋白检测，核酸和蛋白质这两种生物大分子之间的相互作用的研究是现代分子生物学、 生物技术发展最快的领域之一[6]；⑥生物芯片和生物传感器，目前表面固定化分子信标传感器已经被广泛使用[7]。在人类疾病诊断、基因表达和基因图谱等研究中，分子信标固定化磁性纳米颗粒已经被开发出来。已有一种新的基于分子信标共价功能化的壳聚糖技术和金纳米团聚比色的方法对含SSeC基因的鼠伤寒沙门氏菌进行检测[8]。
qPCR的全称是 real time fluorescence quantitative PCR，即实时荧光定量PCR，是一种研究基因表达量的重要方法。qPCR基于 PCR 扩增反应，在 PCR反应体系中引入了荧光基团（染料或者探针），可通过对 PCR产物进行标记跟踪来实时在线监测反应过程，结合相应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。大多数实时 qPCR 方法中，扩增产物的量在每个反应周期进行测量， 在背景信号之上检测到放大产物的第一个周期称为阈值周期，该值(记为 Ct)与初始模板的数量成正比。与传统的 DNA 定量方法相比，实时 qPCR 技术具有许多优点，该技术易于执行、高效和可靠。qPCR 方法很容易适应高通量的检测，允许研究人员在短时间内处理大量样本。此外，可以使用专门为所使用的特定仪器设计的软件和个人计算机收集和分析数据。qPCR 已被用于许多不同的应用，包括检测致病菌、从水样中识别和定量微生物、研究基因表达水平、检测基因组序列中的单核苷酸多态性(SNPs)等[9]。PCR 常用的定量方式三种有：SYBR染料法、TaqMan探针法、分子信标法[10]
四.参考文献
[1]Tyagi S ,Kramer FR. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat biotechnol,1996,14:303-308.
